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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(7): 830-838. |
| Expression of Phospholipase C-beta1 and Phospholipase C-gamma1 on Cholesteatoma. |
| Young Ho Song, Nam Pyo Hong, Dong Yeup Lee, Young Doe Kim, Hwoe Young Ahn, Chang Il Cha |
| Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyung Hee University, Seoul, Korea. |
| 중이진주종에서의 Phospholipase C-β1과 Phospholipase C-γ1의 발현 |
| 송영호 · 홍남표 · 이동엽 · 김영도 · 안회영 · 차창일 |
| 경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
중이진주종ㆍ신호전달기전ㆍPLC 동위효소. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
A histological finding that is the most characteristic of cholesteatoma is the proliferation of the squamous cell. Signal transduction through phospholipase C(PLC) participates in the regulation of epidermal cell growth and differentiation. EGF, PDGF, and TGF-alpha bind to their receptors and thereby induce tyrosine phosphorylation of the phospholipase C-gamma1 (PLC-gamma1). PLC-gamma1 is a substrate for several receptor tyrosine kinases and its catalytic activity is increased by tyrosine phosphorylation. Tyrosine kinase phosphorylation of PLC-gamma1 stimulates PLC activation and cell proliferation.
The G-protein has been shown to specifically activate PLC-beta1. However, the signal transduction pathway and the significance of PLC in cholesteatoma is unknown. This study attempted to provide some evidence that PLC plays a role in cholesteatoma by investigating the distribution and quantity of PLC-beta1 and PLC-gamma1 in the posterior auricular skin and cholestsatoma.
MATERIALS AND METHODS:
Western blotting and immunohistochemical study were performed for 20 cholesteatoma specimens obtained from patients who underwent operation.
RESULTS:
Western blot analyses revealed that PLC-beta1 protein and PLC-gamma1 protein were detectable in cholesteatoma and that these proteins were in higher levels compared with the control. In the imm-unohistochemical study, PLC-gamma1 was detected in the horny cell layer of posterior auricular skin but not in the suprabasal layer and the horny cell layer of cholesteatoma. PLC-beta1 was detected in the primary basal layer and a minor reaction was also noted in the spinous layer of posterior auricular skin.
However, there were detactable reactions in both the basal and the suprabasal layers of cholesteatoma.
CONCLUSION:
The results of this study suggest that there are signal transduction pathways through PLC, over-expression of PLC, the different signaling mechanism by PLC in the basal and the suprabasal layer of cholesteatoma. |
| Keywords:
CholestsatomaㆍSignal transductionㆍPhospholipase C(PLC)ㆍPhospholipase C-beta1(PLC-beta1)ㆍphospho-lipase C-gamma1(PLC-gamma1) |
서론
진주종성 중이염은 만성적인 염증과 재발을 특징으로 하며 주위 골조직을 파괴하여 심한 난청과 치명적인 두개내 합병증을 초래하는 질환으로 그 발생기전 및 병태생리학적 현상에 대하여 그동안 많은 관심과 연구가 있었다. 그러나 진주종의 발생기전과 병태생리에 관한 명확한 기전은 아직 확실하게 밝혀지지 않은 상태이며 특히 중이진주종에서의 세포의 신호전달체계에 대한 연구는 아직 초기단계에 있다.
생물체가 주위 환경의 자극에 반응하고 생명현상을 유지하며 세포내에서 일어나는 여러가지 생리적 현상은 세포의 외부환경으로부터 전달되어 오는 다양한 신호를 세포들 사이에서 대화로 전달하는데 이는 연결물질(ligand)이 세포 표면에 있는 수용체에 결합함으로써 이루어진다. 이렇게 외부의 정보가 세포내로 전달되는 과정을 신호전달(signal transduction)이라고 한다.1) 생체나 세포에서의 생리적 현상은 diacylglycerol(이하 DAG로 약함)와 inositol1, 4, 5-triphosphate(이하 PIP 3로 약함)가 관여하는데,1-4) phospholipase C(이하 PLC로 약함)는 epithelial gro-wth factor receptor(이하 EGFR로 약함)이나 platelet-derived growth factor receptor(이하 PDGFR로 약함)와 같은 receptor protein tyrosine kinase의 기질로 phosphatidyl inositol 4, 5-biphosphate(이하 PIP 2로 약함)를 PIP 3와 DAG로 가수분해하여 protein kinase C(이하 PKC로 약함)활성 및 Ca 2＋의 대사조절, c-fos 와 c-myc 의 발현, MAP kinase의 활성 등의 DNA증가와 세포의 분화 및 세포의 종양화변환을 유발하고 arachidonic acid의 생성에도 관여하는 이차전달물질로 알려지고 있다.1-9)
최근 여러 연구에서 PLC중 PLC-β1은 G-단백질 중 Gq가 연관되고10) PLC-γ1은 EGFR이나 PDGFR과 같은 receptor protein tyrosine kinase와 PLC-γ1내에 존재하는 Src homology2(이하 SH2로 약함) domain에 의해서 반응한 후 활성화되어 신호가 전달되는 것으로 알려졌다.4) 또한 중이진주종상피의 형성과정에 세포의 성장과 분화를 조절하는 유전인자의 이상과 연관될 수 있다는 가설11)이 제시되고 있어 세포의 성장과 분화에 관여하는 여러 신호전달인자들을 규명하는 것이 중요하다고 생각된다. 이에 저자들은 중이진주종에서 일어나고 있는 신호전달체계를 이해하기 위해 단세포항체를 이용한 면역조직화학염색과 western blotting을 통한 중이진주종상피에서 일어나는 과증식의 성향을 PLC의 동위효소의 분포와 PLC의 동위효소의 발현변화의 차이를 관찰함으로써 중이진주종조직에서의 PLC의 관여 여부와 이의 역할을 알아보고져 하였다.
대상 및 방법
조직표본
경희대학교 의과대학 부속병원 이비인후과학교실에서 진주종성 중이염으로 수술을 받은 20명의 환자로부터 수술시 진주종조직을 취하였고 음성 대조군으로 일반 만성중이염으로 진단받은 10명의 환자에서 수술시 이개후부에서 피부편을 채취하였고 양성 대조군으로 10명의 건선환자의 건선부에서 펀치생검한 조직을 사용하였다. 채취한 조직은 즉시 isopentane 용액에 액침하여 -70℃에서 보관하였다. 채취된 조직의 일부는 병리조직검사를 통해 확인하였다.
Western blotting
중이진주종에서 주변기질을 제거한 표피부만을 모은 20 례의 중이진주종상피와 10례의 이개후부의 피부와 건선조직 10례의 상피를 각각으로 한꺼번에 모아서 각각 EBC완충용액(40 μM Tris/HCl, pH 8.0, 120 μM NaCl, 0.5% NP-40, 2 μg/ml aprotinine, 2 μg/ml pepstatin, 2 μg/ml leupeptin, 100 μg/ml phenylmethysulfonyl fluoride)을 가한후 표피파쇄기로 잘게 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 1% SDS(sodium dodecyl sulfate)용액에 반응시킨 후 4℃에서 15,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 취한후 순도를 높이기 위해 원심분리를 2회 시행하였다. 소의 혈청알부민을 표준액으로 하여 각각의 단백질양을 측정후, 1 mg/ml의 단백질이 되게 SDS sample 완충액(100 nM Tris/HCl, pH 6.8, 200 nM dithiothreitol, 4% SDS, 0.2% bromophenol blue, 20% glycerol)을 가한후 100℃에서 5분간 끊여 시료로 사용하였다. 젤은 5% SDS-polyacrylamide를 사용하였고 SDS-PAGE 전기영동을 시행한 후 gel을 30분간 transfer용액으로 평형을 시키고 membrane을 완충용액에 30분간 평형을 시켰다. 이후 western blot용 cassette를 이용하여 전기영동으로 분리된 단백질은 nitrocelluose membrane으로 전기적인 방법으로 옮겼고 이후에 membrane을 건조된 여과지에 옮겨놓고 상온에서 건조시키고 membrane에 단백질이 결합되지 않는 부분을 blocking하기 위해 1% 소의 혈청알부민이 포함된 TBST 20 ml 용액에 1시간 동안 처리하였으며 완충용액을 제거후 TBST용액으로 membrane을 3회 세척을 하였다. 1：1000으로 희석한 PLC-β1와 PLC-γ1의 일차항체용액을 4℃에서 membrane에 반응시켰고 항혈청 희석용액을 제거 후 TBST용액으로 3회 세척하였다. Goat anti-mouse IgG-alkaline phosphatase를 30분간 실온에서 반응시키고 10분씩 TBST 용액으로 세척한 후 alka-line phosphatase 기질용액을 첨가하여 단백질밴드가 나타날때까지 진탕하며 반응시켰다.
면역조직화학적염색
-70℃에서 보관된 조직을 Cryocut(LEICA)을 이용하여 각 조직절편은 6 μm두께로 연속절편으로 제작후 doub-le gelatine-coated slide에 부착하였다. 자른 조직은 실온에서 30분간 건조하고 cold acetone(-20℃)으로 15분간 고정하였고 실온에서 15분간 건조후 0.05M PBS에 조직이 부착된 slide를 2분간 반응시킨후 조직내에 존재하는 페록시다아제(peroxidase)를 제거하기 위하여 0.05 M PBS 50 ml와 30% H 2O 2 2 ml에서 slide를 15분간 처리한 다음 0.05 M PBS에 10분간 3번 세척하고 일차항체가 들어있는 용액 100∼150 μl(5 mg/ml bovine serum albumin, 1.5 % normal hoarse serum, 0.3% Triton X-100)을 점적하여 wet chamber에서 4℃로 overnight로 반응시켰다. 1차 항체용액에서의 반응이 끝나면 조직을 PBS로 10분씩 3번 수세한 후, 2차 항체용액(PBS 18 ml과 0.3% Tritone X-100 2 ml로 Vectastain kit의 biotinylated anti-mouse IgG를 1：200으로 희석)에서 1시간동안 wet chamber에서 실온에서 반응시켰다. 2차 항체 용액과 반응후에 PBS로 10분씩 3차례 수세한 후 avidin-biotin-peroxidase complex용액(ABC용액, Vectastain kit의 A 용액 1：100, B용액 1：100, 0.3% Triton X-100＋)에서 1시간동안 wet chamber에서 실온에서 반응시켰다. 발색제로는 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma)을 사용하였다. 상온에서 3∼4분간 발색반응을 시켰고, 반응이 끝난 후 조직을 PBS로 10분씩 3회 수세후 Hematoxylin으로 대조염색하고 알콜로 탈수하였으며 Xylene으로 투명화시킨 후 polymount(Polyscience)로 cover하고 광학현미경으로 검사 하였다.
일차항체로는 PLC-β1에 대해서는 PLC-β1 단세포항체(Mouse anti-human PLC-β1, Transduction Laboratories)를, PLC-γ1에 대해서는 PLC-γ1 단세포항체(Mouse anti-human PLC-γ 1, Transduction Laboratories)를 사용하였다. PLC-β1 단세포항체, PLC-γ1 단세포항체는 1：150으로 희석하여 사용하였다. 비특이성 peroxidase의 반응에 의한 위양성반응을 확인하기 위해 각각 일차항체, 이차항체, 그리고 이 모두를 생략하고 염색을 시도하여 양성반응은 모두 특이반응임을 확인하였다. 결과판정은 세포의 세포질이나 핵이 갈색으로 염색된 경우를 양성으로 판정하였고 염색정도에 따라 진한갈색으로 염색되었으면(＋＋), 갈색으로 염색되었으면(＋), 염색되지 않았으면(-)로 판정하였다. 관찰방법은 중이진주종상피에서는 세포층이 5층이상인 두꺼운 부위(thick cholesteatoma)와 세포층이 5층미만인 얇은 부위(thin cholesteatoma)로 나누었고 각 상피의 가장 아래층을 형성하는 기저층, 그 상부의 세포핵을 가진 유극층과 과립층, 그리고 최상부의 각질층으로 구분하였고 기저층 아래부위를 기질로 구분하였다.
결과
PLC-β1와 PLC-γ1의 western immunoblotting
중이진주종상피와 후이개피부에서의 PLC 동위효소의 발현여부를 위해 실시한 western blot 분석결과 PLC-β1단백질과 PLC-γ1단백질에 대해 중이진주종, 건선 및 후이개피부에서 40 μg, 60 μg protein/lane의 단백질의 농도에서 양성발현을 보였다. 그러나 중이진주종상피의 양성발현은 후이개피부보다 강한 양성발현을 보였다(Fig. 1). Western blot분석에서 확인된 중이진주종상피에서의 PLC의 증가된 발현양상이 조직 내에서의 어떤 분포를 보이는지 알기위해 면역조직화학적염색을 실시하였다.
PLC-β 1와 PLC-γ 1의 면역조직화학적염색
면역조직화학적 검사를 시행하기전에 hematoxylineosin염색을 시행하여 조직학적 진단을 확인하였다(Fig. 2). 중이진주종상피의 전례에서 두꺼운 부위와 얇은 부위를 확인할 수 있었고 일부에서는 각질층과 과립층에서 핵이 존재하였고 후이개상피에서 보이는 표피능(rete ridge)은 중이진주종상피에서는 관찰할 수 없었다(Fig. 2C and D). PLC-β1에 대한 면역조직화학염색에서 대조군인 후이개상피에서는 기저층은 전례에서, 유극층은 10례중 3례만이 면역염색성이 있었고 과립층과 각질층에서는 면역염색성이 없었다. 그리고 양성대조군인 건선상피에서는 8례는 전층에 면역염색성이 있었고 2례만 각질층에서 면역염색성이 없었다. 중이진주종상피는 전례에서 전층에 면역염색성이 있었으며 PLC-β1에 대한 면역염색성은 후이개상피에 비하여 중이진주종상피와 건선상피에서 강한 강도의 면역염색성을 보였다(Table 1, Fig. 3). PLC-γ1에 대한 면역조직화학염색에서 대조군인 후이개상피에서는 전례에서 각질층은 면역염색성을 나타냈지만 기저층과 유극층은 면역염색성이 없었으며 7례에서는 과립층에도 면역염색성을 보였다. 양성대조군인 건선상피에서는 4례만이 기저층에서 면역염색성이 없었을 뿐 나머지는 전층에서 면역염색성이 있었다. 중이진주종상피는 주로 유극층, 과립층 및 각질층에서 면역염색성이 있었고 기저층에서는 면역염색성이 없었다. 아울러 PLC-γ1에 대한 면역염색성은 후이개상피에 비하여 중이진주종상피와 건선상피에서 강한 면역염색성을 보였다(Table 2, Fig. 4).
고찰
진주종성 중이염은 조직학적으로 골파괴를 동반하는 진주종조직과 만성육아조직으로 구성되고 진주종을 형성하는 세포의 구성 및 주위 점막의 염증세포에 대해서 매우 광범위하게 연구되어 있다.11-16)
진주종상피의 가장 특징적인 조직학적 소견은 각질형성세포의 증식13-15)으로 본 연구에서 관찰 할 수 있었다. 중이진주종상피의 전례에서 각질화된 중층편평상피와 상피하 결체조직인 주변기질을 관찰 할 수 있었고 5층이상의 두꺼운 부위와 4층이하의 얇은 부위를 관찰 할 수 있었으며 각각 기질은 맨아래쪽부터 기저층, 유극층, 과립층과 각질층으로 구성되어 있었고 피부조직과 유사함을 알 수 있었다. 그러나 정상표피보다 얇고 표피능(rete ridge)이 감소되어 있었으며 일부에서는 각질층에 핵이 발견되기도 하였는데 이는 상피층의 과도한 증식의 증거로 생각된다(Fig. 2). 이는 중이진주종에서 Kim13)과 Min14)등의 결과와 동일하였다. 주변기질부에서 육아조직내에 많은 수의 다양한 염증세포가 관찰되었다. 통상적인 조직학적
관찰로는 중이내 진주종의 상피는 보통의 피부조직이나 외이도의 피부보다 얇고 pilosebaceous unit가 없지만, 완전한 표피배아층의 속성을 가지고 있으며 조직학적으로 피부조직과 유사하지만 13) 생물학적 특성은 보통의 피부와 같지 않은 양상을 보여 고식적인 조직학적 관찰로는 인지 할 수 없는 또 다른 차이가 있을 것으로 생각된다.
진주종의 각질형성세포에서 형성된 각질이 화학적 이물질로 작용하는 것이 중요한 발생기전 중 하나이며 진주종상피세포의 증식능의 발현 양상에 대한 연구에서 상피세포가 과증식 상태임이 밝혀졌다.11-15) 그러나 아직까지 중이진주종에서 신호전달과정에 대한 연구는 미비하다.
신호전달과정을 이해하기 위해서는 수용기, membrane phospholipids, 여러 종류의 phospholipase, 그리고 protein phospholylation 등의 상호관계를 이해함이 필요하다.
생체나 세포에서의 생리적 현상은 DAG와 PIP 3가 관여하고 있다.1)3)4) DAG는 PKC를 활성화하는데 활성화된 PKC는 세포내의 대사작용, 세포의 증식 및 분화, 세포의 성장조절, 세포막의 conductance와 transport, 다른 수용체의 강화 또는 억제,4) 유전자발현 및 종양화 변환에 중요한 역할을 하며7) 세포질의 pH를 증가시켜 정지세포(resting cell)를 유사분열환(mitotic cycle)으로 유도한다.6) 또한 DAG는 중성구와 림파구에 대한 chemoattractant이 있어 이들 세포의 침윤을 일으키며17) 그리고 이러한 과정으로 각질세포의 성장과 분화가 이루어진다.1)5) 또한 DAG/PKC경로는 세포의 흥분성을 증가시켜서 다른 신호물질에 대한 세포의 반응성을 변화시킨다.1)3) PIP3는 세포를 직접 활성화시키는 이차전달물질로서 세포내의 형질내세망(endoplasmic reticulum)이라는 칼슘 저장소의 특정한 수용체에 결합함으로써 저장된 칼슘을 유리시켜 세포질내로 Ca 2＋을 방출시킴으로써 세포질내 Ca2＋을 증가시켜 성장인자에 대한 반응으로써 유전자전사에 관여하여 생리적 현상을 조절한다.1)3)6) 이러한 Ca2＋과 DAG를 통한 신호전달은 일시적이지만 다음의 연속되는 신호전달에 필수적이고 synergic effect를 보이며1) 생체나 세포에서 광범위한 생리적 현상을 조절할 수 있다.1)
현재까지 여러증거로 보아 PLC는 세포외부의 신호를 세포내로 전달시키는 과정에서 PIP2를 가수분해함으로써 위와 같은 여러 가지 조절기능에 관여하는 이차정보전달물질인 PIP3와 DAG를 생성하는 효소로서 신호전달기전에 있어서 중추적 역할을 한다.1)2)5-7)
현재 PLC-β1은 G-단백질 중 Gq가 연관되어 있고 PLC-γ1은 EGFR이나 PDGFR와 같은 receptor protein tyrosine kinase의 기질로5-7) 크게 3가지의 방식으로 활성화된다. 첫째는 PLC-γ1내의 tyrosine 잔기의 인산화로 transforming growth factor-α (이하 TGF-α로 약함), PDGFR, EGFR는 PLC-γ1의 tyrosine 잔기중 Tyr-472, Tyr-771, Tyr-783, Tyr-1253에 인산화를 유발하며8)18) PLC를 활성화하는데 Tyr-783의 인산화가 PLC-γ 1의 활성에 필수적인 과정이다.4)6-8)18) 두번째 활성방식은 세포외부의 칼슘에 의한 tyrosine kinase의 활성조절로 PLC-γ1을 활성화하는 기전으로 세포의 분화과정에 관여한다.5)9) 그리고 PLC-γ1내에 존재하는 Src homology2(SH2) domain에서 receptor protein tyrosine kinase와 반응한다.4-9) 배양액 내에 칼슘 농도를 증가시키면 각질형성세포의 분화가 촉진되는데 농도증가에 비례하여 PLC-γ 1과 PLC-δ 1의 발현이 증가된다.9) 또한 EGF는 G결합단백질을 통하여 PLC를 활성화시킨다.1)7) 그리고 세 번째 활성화는 T세포와 관련이 있으며19) 수용체를 거치지 않고 T-cell antigen receptor(TCR)-CD3복합체에 tyrosine kinase가 결합함으로써 PLC-γ 1는 활성된다.19) 그리고 PLC-δ의 작용기전은 아직까지 알려져 있지 않다.2)9) 또한 PLC는 PIP 2를 가수분해하여 PIP3와 DAG를 생성하는 기능이외에도 prostaglandine과 leukotriene의 전구체인 arachidonic acid의 생성에도 관여한다.3) 그리고 서로 다른 조직과 세포에서 EGF와 EGFR을 통한 신호전달이 다른 것은 각기 다른 EGFR이 각각에 특이적인 G결합단백질의 아류형과 반응하여 신호전달을 형성하거나 EGFR이 서로 다른 PLC의 동위효소와 작용하여 이루어지는 것으로 생각되며18) IP형성은 조직이나 세포에 특이적인데 PLC동위효소나 PKC동위효소의 발현의 차이로 인한 차이점으로 생각되어진다.1)7) 그러나 아직까지 PLC 동위효소에 대한 정확한 조절기능 및 기전은 알려져 있지 않다. 하지만 과증식 및 비정상적인 성숙(maturation)이 특징인 건선에서는 PLA 2, EGFR의 증가, PLC활성도의 증가,3) DAG의 증가,1) PIP 2의 가수분해능의 증가3) 및 PKC의 downregulation으로20) 부적절한 신호를 전달하여 세포의 증식, 성장 및 분화에 이상이 초래되어지는 과정이 병태생리 중 한 기전이다.1)20) 그리고 악성종양에서 면역조직화학염색에서 TGF-α , EGF, EGFR, PLC는 과발현을 하는데 이러한 이상발현은 각 세포들의 통제를 받지 못한 증식과 신체 항상성이 무너진 결과이다.1)3)9)18)19)
현재까지 진주종의 발생과 성장기전으로 생각되어지는 점은 여러요인들이 복합적으로 작용하여 진주종을 형성한다고 생각되고 있으나 아직도 상반된 주장을 하는 등 연구할 부분이 많다. 그리고 중이진주종의 형성에도 현재까지는 정확한 사실은 알 수 없지만 분명히 신호전달체계는 있다고 생각되어진다.6)12)14-16) 고막함몰과 염증에 의한 외부의 자극은 EGFR, EGF, TGF-α 등의 여러성장인자에 관여하고 기저세포내에서 tyrosine kinase를 활성화시키고, 다시 특정한 신호전달경로를 통해 핵내에서 c-jun이나 c-fos 등의 transcription factor의 발현을 통해 DNA에 변화를 초래할 수 있게 된다.11) 이로 인해 세포주기의 변화가 유도되어 세포의 증식도가 변하게 된 결과 상피세포는 과증식 성향을 띄게 되어 진주종의 특성을 갖게 된다.16)
본 연구에서는 중이진주종상피에서 PLC-β1은 전층에서 강한 면역염색성을 보였고 PLC-γ1은 기저층보다는 유극층, 과립층, 각질층 등의 기저직상부층에서 강한 면역염색성을 보여 후 이개상피와는 다른 양상을 보였다. 이는 심부외이도상피에서는 western blot에서 PLC-γ1이 검출되지 않았고 면역조직화학염색에서 심부외이도상피에서 일부에서 기저층과 기저직상부층에서 면역염색성을 보인 반면 중이진주종상피에서 전층에서 면역염색성을 보였다는 Chun12)의 결과와는 다소 다르다. Chun12)은 파라핀포매조직을 사용한 반면 본 연구는 -70℃에서 냉동보관을 한 조직을 사용하였으며 사용한 일차항체가 다르며 본 연구에서는 1：150으로 일차항체를 희석하였으며 대조군으로 후이개피부와 외이도상피를 사용한 점에서 면역염색성과 western blot분석의 차이가 있다고 저자들은 사려된다.
본 연구로 후이개상피와 중이진주종상피에서 PLC를 매개로 하는 신호전달과정이 존재함을 알 수 있었다. 후이개상피의 경우 기저층에서는 PLC-β1이, 상부층에서는 PLC -γ1이, 중이진주종상피의 경우 기저층에서는 PLC-β1의 발현만 관찰되어 기저층은 PLC-β1을 매개로 하는 신호전달기전이, 상부층에서는 PLC-β1와 PLC-γ1의 발현이 관찰되어 이들을 매개로 하는 신호전달기전이 관여하리라 생각된다. 그리고 상층부로 갈수록 PLC-γ1의 발현 양상은 강한 면역염색성을 보인 반면 PLC-β 1은 점점 약한 면역염색성을 보여 상층부로 갈수록 PLC-γ1의 신호전달기전이 더욱 관여하리라 생각된다. 이런 결과로 저자들은 중이진주종상피의 기저층에서는 PLC-β1을 매개로 과증식의 성향을 갖게되고 기저층보다 분화도가 높은 상피의 상층부로 진행할수록 PLC-γ 1을 매개로 신호전달이 활발히 이루어짐을 시사하는 결과라 생각된다.
저자들은 이러한 상피의 분화도는 PLC가 관여하기 이전의 단계에서 차이가 있을 것으로 생각된다. 첫째로 기저직상부층에서 tyrosine kinase의 활성을 증가시키는 EGF, EGFR, TGF-α 등의 성장인자의 과발현을 보고한 이전 연구를13-16) 토대로 중이진주종상피의 기저층에서 PLC-β1의 활성이 이루어지며 이는 상층부로 분화가 되어도 이러한 성향은 유지되며 기저직 상부층에서는 EGF, EGFR, TGF-α 등의 성장인자의 증가로 tyrosine kinase는 활성화되어 PLC-γ1와 PLC-β1의 활성증가를 유발하여 PIP3와 DAG의 증가로 인한 상피의 증식과 분화를 유도하며 이러한 성향은 정상후이개상피에 비해서 진주종상피의 과증식을 유발할 것으로 생각된다. 둘째로 PLC-β1와 PLC-γ1의 활성은 G결합단백질이 관여하는데 상피분화도에 따른 즉, 기저층과 상층부의 G결합단백질의 아류형의 차이로 PLC-β1와 PLC-γ1의 면역염색성의 발현에 차이가 있을 수 있다. 즉, 후이개상피에서는 Gq결합단백질이 기저층에서만 분포하여 기저층세포의 분화를 조절하나 중이진주종상피의 전층에 분포하여 이를 매개로 PLC-β1의 과발현을 유도하고 PLC-γ1경우에는 Gs결합단백질이 후이개피부에서는 없거나 미약하게 분포하지만 중이진주종에서는 기저직상부층에 분포하여 PLC-γ1의 과발현이 유발되었으리라 생각된다. Park15)은 EGFR은 중이진주종상피에서 과발현하고 TGF-α는 정상상피에서는 최상층부에, 진주종상피에서는 전층에 과발현을 보였다는 결과와 본연구의 결과를 종합하면 다음과 같다. 우선 진주종상피에서 PLC-β1와 TGF-α의 과발현 부위가 일치하고 상피조직에서는 PLC-γ1과 TGF-α의 과발현 부위가 일치함을 알 수 있다. 이는 정상상피에서는 TGF-α는 최상부층인 각질층에서 G결합단백질중 한 아류형과 반응한 후 PLC-γ1의 활성을 유발하나 중이진주종상피같은 병적인 상황에서는 TGF-α 는 PLC-β 1의 활성의 증가에 관여하리라 생각할 수 있다. 하지만 또 다른 가설로 두꺼운부위의 진주종상피에서는 기저층은 TGF-α 에 의해 PLC-β1의 활성을, 기저직상부층 이상에서는 EGF와 TGF-α에 의한 PLC-β1와 PLC-γ1의 활성이 유도되며 얇은부위의 진주종상피에서는 기저층은 EGF에 의해 PLC-β1의 활성화가, 기저직상부층은 TGF-α로 PLC-β1와 PLC-γ1의 활성이 유도되며 최상부층인 각질층에서는 TGF-α로 PLC-γ1의 활성의 증가가 있음을 생각할 수 있다. 그러나 이러한 관점은 본연구와 이전 연구를 종합한 하나의 가설일 뿐이다. 다만 본 연구의 결과로 중이진주종상피의 과증식에 기저층은 PLC-β1을, 기저직상부와 이의 상층부에는 PLC-β 1와 PLC-γ 1을 매개로 하는 신호전달기전이 관여함을 알 수 있었고 PLC의 과발현과 PLC 동위효소발현의 차이에 EGF, EGFR, TGF-α 등의 여러 성장인자가 관여함과 중이진주종상피에서의 tyrosine kinase의 활성을 간접적으로 유추할 수 있는 결과이다. 이는 과증식 성향을 가진 기저세포와 인접세포가 상층부로 이동하면서 오히려 정상과는 달리 terminal differentiation의 가속이 되고 이 결과 soft keratinization을 초래하고 과다한 케라틴이 생성되고 이과정에 apoptosis가 관여할 것이라는 가설11)을 설명할 수 있는 하나의 결과라 생각된다.
본 연구로 중이진주종에서의 신호전달과정은 정확히 규명할 수는 없었다. 그러나 본 연구를 토대로 세포막과 세포질에서 형성된 이차전달물질인 PLC이후의 과정과 핵내에서 어떠한 변화가 유발되는지, 유전자 이상과 연관여부를 알아보는 것이 중이진주종상피에서의 신호전달기전과 발생기전의 규명에 필요하리라 생각되고 아울러 PLC가 관여하기 이전인 각종 성장인자와 G결합단백질의 여러 아류형과 PLC 동위효소의 관련여부에 대한 연구가 필요하리라 사려된다.
결론
중이진주종은 비정상적으로 과각화증을 일으키는 질환으로 그 발생기전이나 병태생리에 관한 명확한 기전은 아직 밝혀지지 않은 상태이며 중이진주종에서의 신호전달체계에 대한 관심은 최근의 일이다.
저자들은 중이진주종에서 EGFR이나 PDGFR와 같은 receptor protein tyrosine kinase의 기질로 PIP2를 PIP3와 DAG로 가수분해하여 PKC활성 및 Ca2＋의 대사조절, c-fos와 c-myc의 발현, 세포의 분화 및 세포의 종양화변환을 유발하는 PLC의 역할을 western blot과 면역조직화학염색를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
중이진주종상피에서 PLC-β1단백질과 PLC-γ1단백질을 매개로 하는 신호전달과정이 있고 이는 정상후이개상피보다 과발현함을 western blot분석과 면역조직화학염색로 확인 할 수 있었다. 세포의 분화도에 따라 다른 방식의 신호전달기전이 중이진주종상피의 기저층과 기저직상부층에 있음을 시사하는 결과를 얻었다. 본 연구의 결과를 토대로 이차전달물질인 PLC이후의 과정과 핵내에서 어떠한 변화가 유발되는지, 또는 유전자 이상과의 연관여부를 알아보는 것이 중이진주종상피에서의 신호전달기전과 발생기전을 규명하는데 필요할 것으로 생각된다. 본 연구의 실험결과가 현재까지 중이진주종에서 연구된 여러가지 성장인자들과 앞으로 연구되어질 핵내의 신호전달기전과 유전자이상 등의 관련여부를 이해하는데 있어서 귀중한 자료를 제공할 것으로 생각되며 중이진주종상피에서의 과증식과정을 이해하는데 도움이 될 것으로 생각된다.
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