| Typing of Human Leukocyte Antigen in Patients with Inner Ear Disorders-Preliminary Report. |
| Sang Won Yeo, Choong Ill Bang, Shi Nae Park, Ki Hong Chang, Byung Do Suh |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medcine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. swyeo@cmc.cuk.ac |
| 내이질환 환자에서 인체 백혈구 항원(HLA)의 형별분석(Ⅰ) |
| 여상원 · 방충일 · 박시내 · 장기홍 · 서병도 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
|
|
|
|
|
| 주제어:
인체백혈구항원ㆍ내이질환ㆍ자가면역. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
It has been well known that a number of autoimmune diseases are associated with certain types of human leukocyte antigen (HLA). The pathogenesis of inner ear disorders including Meniere's disease, idiopathic progressive sensorineural hearing loss, sudden sensorineural hearing loss and otosclerosis has not been clearly understood; however it is thought that some of the disorders are related to abnormal immune response, especially autoimmunity. This study was performed to investigate the association between HLA gene and inner ear disorders in Korean and confirm that some of inner ear disorders are mediated by abnormal immune response.
MATERIALS AND METHODS:
For 29 patients with inner ear disorders and 20 healthy persons without any ear disorders, we performed serologic tests for the typing of HLA-A and HLA-B, and reverse dot hybridization for the typing of HLA-DR. In addition, we also carried out both immunologic screening tests and Western blotting immunoassay against cow's inner ear proteins.
RESULT: (1) The frequencies of HLA-A26, HLA-B61, HLA-B62, and HLA-DRB1*04 are significantly increased in the progressive idiopathic sensorineural hearing loss. (2) HLA-DRB1*04 is associated with Meniere's disease. (3) Both HLA-A26 and HLA-B61 are associated with the sudden sensorineural hearing loss.
CONCLUSION:
Several types of HLA genes were shown to be significantly associated with inner ear disorders despite the small sample size. The results suggest that several specific HLA gene products may confer susceptibility to inner ear diseases. |
| Keywords:
Human leukocyte antigenㆍInner ear disorderㆍAutoimmunity |
서론
아직 정확한 원인 및 발병기전이 밝혀지지 않은 메니에르병, 돌발성 난청 및 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청등의 내이질환들에서 면역기능 이상 및 자가면역과의 관련성이 알려진 후 그에 대한 많은 실험연구와 임상조사가 보고되고 있다.1-7) 그중에서는 다른 자가면역질환과 같이 내이질환과 인체 백혈구 항원(Human Leukocyte Antigen, HLA) 형별과의 연관성을 조사하여 발표한 보고들이 있으나8-11) 그 결과가 다양하고 또한 민족간의 차이로 인한 특성이 간과되어 있었다.
일부 인체 백혈구 항원과의 관련성이 밝혀진 질환에서 인종에 따라 각기 다른 형별과 관련이 있으며 인체 백혈구 항원 형별이 인종이나 민족에 따라 매우 다른 분포빈도를 보이는 점으로 미루어 한국인에서 내이질환 환자와 인체 백혈구 항원 형별과의 연관성을 조사하는 것은 내이질환들의 면역학적 관련성과 인체 백혈구 항원의 역할을 연구하는데 많은 기여를 할 것으로 생각된다. 12)13) 국내에서는 아직까지 이에 대한 보고가 없어 저자들은 메니에르병, 돌발성 난청 및 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청을 앓고 있는 환자들의 인체 백혈구 항원의 형별분석을 시행하여 특정 항원과의 관련성을 알아보고 이를 기초로 향후 내이질환들의 면역학적 발생기전과 감수성에 대한 연구와 진단 및 면역학적 치료의 발전에 기여하고자 본 연구를 시행하였다.
대상 및 방법
대상
과거에 전신적인 면역질환을 앓았던 기왕력이 없으며 뚜렷한 발생원인을 알 수 없는 메니에르병 환자 9명, 돌발성 난청 환자 10명, 그리고 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 환자 10명등 29명과 과거에 귀질환을 앓은 과거력이 없으며 청력검사상 정상청력을 갖고 있는 성인 20명을 대상으로 하였다.
인체 백혈구 항원의 형별분석
Class Ⅰ 분자
5 cc의 혈액을 채취하여 density-gradient centrifuge하여 임파구를 분리하고 각 인체 백혈구 항원에 대한 항체가 포함된 HLA plate kit에 점적하여 항원-항체반응을 유발하고 가토에서 추출한 보체를 첨가하여 보체의존성 세포독성반응을 일으켜 Eosin대조염색하에 HLA-A와 HLA-B의 표현형을 분석하였다. 14)
Class Ⅱ 분자
HLA-DRB1 유전자중 hypervariable region인 exon2 부위에서 각 대립유전자에 특이한 염기서열을 택하여 probe를 제작하였고 이들을 효율적으로 결합시키기 위해 5’에 allele specific probe를, 3에 T7 blue plasmid에 특이한 U-19mer primer의 염기서열을 연결한 ‘probe-primer’를 제작하여 T7 promoter primer와 함께 T7 blue plasmid를 target DNA로 하여 PCR로 증폭하고 이를 immobilizing probe로 사용하였다. sample에 PCR-K buffer를 첨가하고 58℃에서 60분간 동안 처리하고 용해시킨 다음 95℃에서 10분간 처리하여 proteinase K를 불활성화시켜 DNA를 추출하였다. DNA 시료 1 μl에 10X PCR buffer, 2 mM dNTP, left-right primer 20 ng, Taq DNA polymerase, D/W를 섞은 혼합액 9 μl를 가한 총 10 μl를 35 cycle로 증폭시켰다. PCR로 증폭한 immobilizing probes를 0.4 N NaOH, 25 mM EDTA로 10분간 변성시킨 후 nylon membrane에 점적하고 80℃ vaccumdry oven에서 1시간동안 처리하였다. 탐색자가 점적된 membrane을 교잡용액(5x SSC, 0.5% blocking reagent, 0.1% N-lauroysarcosine, Na-salt, 0.02% SDS) 500 μl로 1시간동안 42℃에서 전교잡 시킨 후 digoxigenin으로 표지된 DRB1 probe와 증폭 DNA를 교잡용액에 섞어 2시간동안 반응시킨 후 0.1% SDS와 2X SSC 및 TMAC solution으로 세척하였다. 이어서 alkaline phosphatase가 결합된 anti-digoxigenin antibody를 이용하여 반응시키고 NBT와 X-phosphate로 염색후 유전자형을 분석하였다.15)
면역학적 선별검사
면역활성도(immune activity)를 조사하기 위해 혈액을 채취하여 (1) 적혈구 침강속도(남：0∼20 mm/hr, 여：0 ∼25 mm/hr) 및 C-reactive protein(5 mg/dl이하), (2) 혈청내 면역글로블린 G(IgG, 800∼1700 mg/dl) 및 면역글로블린 M(IgM, 남：50∼320 mg/dl, 여：60∼370 mg/dl), 보체 C3(50∼90 mg/dl) 및 C4(10∼40 mg/dl)농도, (4) 자가항체 rheumatoid factor(19.8 IU/ml 이하), anti-DNA antibody(20 IU/ml 이하), 및 antinuclear antibody, (5) cryoglobulin, (6) fluorescent treponemal antibody absorption test(FTA-ABS)등 6종류의 면역학적 검사를 시행하여 한가지 이상의 세부검사항목에 이상을 나타낸 면역검사가 2종류 이상인 경우를 면역학적 선별검사 양성으로 판정하였다.
Western blot 면역검사
신선한 암소의 내이항원 단백질 추출물과 표준분자량표지(standard molecular weight marker)로 SDS-Polyacrylamide 전기영동(SDS-PAGE)후 내이질환 환자와 정상 대조군에서 얻은 혈청으로 Western blot 면역검사를 시행하여 68 kD 내이 항원 단백질에 대한 항체를 관찰하였다.
통계분석
각각의 내이질환과 인체 백혈구 항원과의 연관성, 면역학적 선별검사 및 Western blot 면역검사의 결과와 인체 백혈구 항원과의 연관성 등에 대해 χ 2 검정을 이용하여 유의성을 검정하였다.
결과
정상 대조군에서의 인체 백혈구 항원 형별분석
인체 백혈구 항원 A형(HLA-A)에서는 한국인에서 높은 빈도를 보이는 2, 11, 24, 33형의 빈도가 높게 나타났으며 HLA-B에서는 13, 27, 35, 51, 54, 58형이 많았고 HLA-DR에서는 1, 7, 8, 14형이 많아 대체적으로 한국인의 인체 백혈구 항원 형별분포14)와 유사한 양상을 보였다.
내이질환에서 인체 백혈구 항원 A형(HLA-A) 형별분석
HLA-A26형이 돌발성 난청과 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 환자에서 발현빈도가 의의있게 높았으며 그외 A2형이 메니에르병, 감음신경성 난청 및 돌발성 난청에서, A24형이 돌발성 난청에서 높은 빈도의 발현을 보였으나 정상인과 비교해 의의있는 차이를 보이지 않았다(Table 1).
내이질환에서 인체 백혈구 항원 B형(HLA-B) 형별분석 HLA-B61형은 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청과 돌발성 난청 환자에서, HLA-B62형은 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 환자에서 빈도가 의의있게 높았다. 그외 B13형이 돌발성 난청에서, B35형이 감음신경성 난청에서 빈도가 높았으나 정상인에 비해 의의있는 변화를 보이지 않았다(Table 2).
내이질환에서 인체 백혈구 항원 DR형(HLA-DR) 형별분석
HLA-DRB1*04형의 빈도가 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 환자와 메니에르병 환자에서 의의있게 높았으며 그외 HLA-DRB1*02가 메니에르병과 감음신경성 난청에서, HLA-DRB1*14가 감음신경성 난청에서 빈도가 높았으나 여러 보고8)9)에서 관련성이 있는 것으로 알려진 HLA-DR3형은 없었다(Table 3).
일배체형(Haplotype)
원인미상의 진행성의 감음신경성 난청환자에서 HLA-A26/B61, A26/B62, A26/B62/DR4 일배체형의 발현증가가 있었으나 통계학적인 유의성은 없었다(Table 4).
면역학적 선별검사 및 Western blotting 면역검사 결과와 인체 백혈구 항원과의 관계
면역학적 선별검사에서 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 환자의 50%, 메니에르병 환자의 22.2%, 돌발성 난청 환자의 10%에서 양성을 보였으며 68 kD 내이 항원 단백질에 대한 항체는 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 환자의 80%, 메니에르병 환자의 44.4%, 돌발성 난청 환자의 20%에서 검출되었다. 그러나 인체 백혈구 항원과의 유의한 연관성은 없었다(Table 5).
고찰
인체 백혈구 항원은 동종항원의 고유한 체계로 사람의 6번 염색체의 단완(short arm)에 위치한 주조직적합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 유전자의 생성물로 Class Ⅰ 분자와 Class Ⅱ 분자로 분류되고 면역체계에서 세포와 세포간 상호작용에 중심적인 역할을 한다. Class Ⅰ 분자에는 HLA-A, HLA-B, 그리고 HLA-C 분자가 포함되며 체내의 모든 유핵세포 표면에 표현되어 세포독성 T 임파구의 기능을 조절한다. Class Ⅱ 분자는 주로 B 임파구나 대식세포 등의 항원제시세포(Antigen presenting cell)와 활성화된 T 임파구에 표현되어 가공된 펩타이드항원을 CD4+ T 임파구에 노출시키며 Class Ⅱ 분자에는 HLA-DR, HLA-DQ, HLA-에 등이 포함된다.14)
인체 백혈구 항원은 다형성(polymorphism)을 가져 Class Ⅰ 분자는 현재까지 알려진 41종류의 A 대립유전자, 61종류의 B 대립유전자와 18종류의 C 대립유전자에서, Class Ⅱ 분자는 60개의 DRB1, 14개의 DQA1, 19개의 DQB1, 그리고 38개의 DPA1 대립유전자에서 전사되는 많은 표현형을 가지고 있으며 인종, 민족, 지역에 따라 독특한 표현빈도를 보인다. 또한, 인체 백혈구 항원은 유전자 결연 불균형이라는 유전자 발현의 특징을 갖는데 이는 일배체형(Haplotype)에서 두 유전자좌에 나타나는 대립유전자의 발현빈도가 각 유전자의 발현빈도로 추산한 것보다 훨씬 빈발하게 나타나는 것이다.14)
따라서, 이러한 다양성과 면역체계에서의 기능으로 보아 특정 인체 백혈구 항원은 어떤 질환의 발병에 대한 감수성과 관련이 있을 수 있다는 추측 아래 많은 질환, 특히 자가면역성 질환, 유전성 질환, 감염질환 등에서 관련성이 일반적으로 알려져 있다.
이처럼 면역학적 이상과 연관되어 있고 질병의 병리기전이 불명확한 많은 질환들이 인체 백혈구 항원과 연관되어 있는데 그 중 강직성 척추염은 HLA-B27, 류마티스 관절염은 HLA-DR4, Sjogren씨 증후군은 HLA-DRW52, 인슐린의존성 당뇨병은 HLA-DQW8 등이 연관되어 있는 것으로 보고되었다.14)
내이질환에서는 이경화증, 메니에르병, 돌발성 난청 및 원인미상의 감음신경성 난청 등에서 특정 인체 백혈구 항원과의 관련성이 보고된 바 있으나8-11) 그 수가 많지 않고 각 보고자간의 연구결과가 일치하지 않으며, 인종이나 민족간의 특정 인체 백혈구 항원의 빈도가 다르므로 외국의 연구결과를 한국인에게 적용시키는 것은 적당하지 않을 수 있다.
주조직 적합체의 특정 인체 백혈구항원이 질병의 발생에 작용하는 기전에 대해 여러 가지 가설이 알려져 있다. 하지만 어느 한가지 기전으로만 발생한다고 하기보다는 여러 가지 요소가 복합되어 발생하는 것으로 생각되고 있다. 일반적으로 면역 이상에 의한 내이질환의 발병에는 유전학적 감수성과 환경요인의 상호작용이 요구되며 실제로 많은 자가면역성 질환들은 특히 D/DR 유전자좌로 기록되어 있는 인체 백혈구 항원들과의 연관성을 보여주고 있다.8)9)14) 특정 인체 백혈구 항원-연결성 면역반응유전자들(Ir genes)이 자가항체성 반응의 양을 조절하며, 또한 인체 백혈구 항원 유전자들은 임파구 상호작용들의 조절에 관여하므로 비정규적 면역조절을 통해서 자가면역에 대한 영향을 나타나게 된다.14)17) 한편 Cytomegalovirus나 Parvovirus 등의 바이러스 감염이 유전학적으로 감수성이 있는 환자에서 바이러스와 MHC Class Ⅱ 분자간의 공통된 구조로 인해 자가면역반응을 일으킬 수 있고18)19) 특정 인체 백혈구 항원이 바이러스나 Toxin에 대해 세포 표면 수용체로 작용할 수도 있으며 서로 다른 유형의 인체 백혈구 항원이 각기 다른 반응을 보일 수 있다. 또한 Class Ⅰ 항원의 경우 세포 독성 T 세포의 작용이 특이성을 가질 수도 있다.9)17)
베게너육아종증, 류마티스성 관절염, 결절성 다발성 동맥염, 재발성 다발성 연골염, 전신성 홍반성 루프스 등의 전신적 자가면역성 질환에서 내이증상이 발현될 수 있으며, 동물실험과 인체연구를 통해 자가항체의 생성, 면역복합체 침착, T 임파구 중개성 자가면역성 등이 관찰되므로서20) 아직 발생원인이 불분명한 내이질환에서 면역학적 이상이 내이손상의 한 원인이 될 수도 있음을 시사하고 있다.
내이질환에서의 인체 백혈구 항원와의 연관성에 대해 Xenellis 등10)은 메니에르병 환자의 75%에서 HLA-Cw7 항원을 가지고 있었으며 HLA-A1과 B8의 빈도가 대조군에 비해 높다고 하였고 Bowman 등 11)은 자가면역성 감음신경성 난청에서 다른 인체 백혈구 항원과의 연관성은 없었으며 단지 HLA-DR4의 빈도가 감소하였다고 하였다. Bernstein과 Yoo 등9)은 감음신경성 난청과 이경화증 환자에서 HLA-A1/B8/DR3 일배체형의 빈도가 의의있게 높았다고 하였고 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청에서 인체 백혈구 항원 Class Ⅱ 관련성을 유전자 수준에서 조사한 Cao 등8)은 HLA-DRB1*0301, HLA-DRB3*0101, HLA-DQB1*0301, HLA-DPB1*0401의 빈도가 의의있게 높았고 HLA-DQB1*0301의 빈도는 의의있게 감소하였다고 하였다. 하지만 인체 백혈구 항원 형별은 인종, 민족간에 빈도의 차이가 많아 동일한 인종에서 정상대조군과 환자군을 비교하여야 하고 다른 인종에서의 결과를 적용시킬 수는 없다. 자가면역성 갑상선질환에서 백인의 경우 HLA-B8이 관련성이 있으나 일본인에서는 HLA-B35, 중국인에서는 HLA-Bw46, 한국인에서는 HLA-A11과 HLA-DRw8의 빈도가 높은 것으로 보고되었다.12)13)
본 연구에서는 HLA-A26, HLA-B61, HLA-B62, HLA -DR4형들이 내이질환과의 관련성을 보였다. 하지만, 인체 백혈구 항원 연관성에 대한 연구의 특징상 많은 대상이 요구되나 조사의 초기단계인 본 연구에서는 연구대상의 수가 적어 그 관련성에 대해서는 지속적인 연구가 필요하다. 또한 인체 백혈구 항원 관련연구에서는 감수성이 적은 항원도 발견할 수 있지만 본 연구에서는 아직 찾을 수는 없었다. 그러나, 기존 한국인에서의 인체 백혈구 항원 빈도분포와 정상대조군의 인체 백혈구 항원 빈도분포에서 낮은 빈도를 보인 인체 백혈구 항원 형별들이 눈에 띄게 많았다는 것은 향후 계속될 연구에서 보다 구체적인 관련성을 밝힐 수 있을 것으로 생각된다. 아울러서 내이항원에 대한 항체 형성과의 관계 및 유전자 불균형에 의한 일배체형과의 관련성에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결론
특정 인체백혈구항원은 인체의 면역체계에서 매우 중요한 역할을 하고 있으며 전신성 자가면역성 질환, 이식거부반응, 유전성 질환 등의 발생에 관여하고 있음이 밝혀져 있다. 저자들은 메니에르병, 돌발성 난청, 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청 등과 같은 내이질환 환자에서 인체 백혈구항원의 형별분석을 시행하여 이들 내이질환의 발생과 인체백혈구항원과의 연관성을 연구하였다. HLA-A26형과 B61형이 돌발성 난청과, HLA-DRB1*04가 메니에르병과, HLA-A26, B61, HLA-DRB1*04가 원인미상의 진행성의 감음신경성 난청의 발생과 연관되어 있음을 알 수 있었다. 이러한 연구결과는 향후 내이질환의 치료에 유전자치료의 가능성을 시사하고 있다.
REFERENCES
1) Hughes GB, Kinney SE, Barna BP, et al. Autoimmune endolymphatic hydrops: Five-year review. Otolaryngol Head Neck Surg 1988;98:221-5.
2) Harris JP, Sharp PA. Inner ear autoantibodies in patients with rapidly progressive sensorineural hearing loss. Laryngoscope 1990;100:516-24.
3) McCabe BF. Autoimmune sensorineural hearing loss. Ann Otol 1979;88:585-9.
4) Veldman JE, Roord JJ, O’Connor AF, Shea JJ. Autoimmunity and inner ear disorders: An immune-complex mediated sensorineural hearing loss. Laryngoscope 1984;94:501-7.
5) Hughes GB, Kinney SE, Barna BP, Calabrese LH. Practical versus thoretical management of autoimmune inner ear disease. Laryngoscope 1984;94:758-67.
6) Yoo TJ, Stuart JM, Kang AH, Townes AS, Tomoda K, Dixit S. Type Ⅱ collagen autoimmunity in otosclerosis and Meniere’s disease. Science 1982;217:1153-6.
7) Yoo TJ. Etiopathogenesis of Meniere’s disease: A hypothesis. Ann Otol Rhinol Laryngol (suppl) 1984;113:6-12.
8) Cao MY, Thonnard J, Deggouj N, et al. HLA class Ⅱ-associated genetic susceptibility in idiopathic progressive sensorineural hearing loss. Ann Otol Rhinol Laryngol 1996;105:628-33.
9) Bernstein JM, Shanahan T, Yoo TJ, Ye XJ. HLA antigens and inner ear disease. Immunobiology in Otology, Rhinology and Laryngology 1990:3-11.
10) Xenellis J, Morrison AW, McClowskey D, Festenstein H. HLA antigens in the pathogenesis of Meniere’s disease. The J of Laryngol and Otol 1986;100:21-4.
11) Bowman CA, Nelson RA. Human leukocyte antigens in autoimmune sensorineural hearing loss. Laryngoscope 1987;97:7-9.
12) Huh KB, Lee HC, Kim HN, et al. HLA in Korean patients with autoimmune thyroid diseases. Korean J Int Med 1986;1:243-7.
13) Rhee BD, Choi SJ, Park SW, et al. HLA and insulin-dependent diabetes mellitus in Koreans. Korean J Int Med 1987;2:135-9.
14) Yunis EJ, Dupont B. The HLA system. In: Nathan DG, Osk TA. Hematology of infancy and children. 3rd ed. Philadelphia, Saunders;1987. p.1692-721.
15) Han H, Lim BU, Lee IS, KIM TG. New strategy to improve the reverse dot hybridization: Application to generic HLA-DQA1 genotyping. Korean J Immunol 1994;16:163-70.
16) Kim TG, Han H, Lim BU, Kim WI, KIM SM. Distribution of HLA class Ⅰ alleles and haplotypes in Korean. J of Korean Medical Mcience 1993;8:180-6.
17) Amos DB, Word FE. Theoretical consideration in the association between HLA and disease. In: Dausset J, Svejgaard A. HLA and disease. 1st ed. Baltimore;1977. p.269-79.
18) Arnold W, Niedermeyer HP, Lehn N, Neubert W, Hofler H. Measles virus in otosclerosis and the specific immune response of the inner ear. Acta Otolaryngol (Stockh) 1996;116:705-9.
19) Cotter CS, Singleton GT, Corman LC. Immune-mediated inner ear disease and Parvovirus B19. Laryngoscope 1984;104:1235-9.
20) Haris JP, Darmstadt GL. Sensrineural hearing loss: Medical therapy. In: Gates G. Current therapy in Otolaryngology-Head and Neck Surgery 1990:50-6.
|
|
PDF Links
Full text via DOI 
Download Citation 
