Expression of Tumor Necrosis Factor-alpha and Interleukin 10 in the Middle Ear Effusion and Histopathological Changes of the Middle ear Mucosa in the Rats with Experimental Otitis Media with Effusion.

Chang, Ki Hong; Yeo, Sang Won; Suh, Byung Do

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(6); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(6): 703-711.

Expression of Tumor Necrosis Factor-alpha and Interleukin 10 in the Middle Ear Effusion and Histopathological Changes of the Middle ear Mucosa in the Rats with Experimental Otitis Media with Effusion.

Ki Hong Chang, Sang Won Yeo, Byung Do Suh

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. khchang@cmc.cuk.ac.kr

실험적 삼출성 중이염을 일으킨 흰쥐의 중이저류액내 Tumor Necrosis Factor-α, Interleukin 10의 발현 및 중이점막의 병리조직학적 변화

장기홍 · 여상원 · 서병도

가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: 싸이토카인ㆍ면역 매개성ㆍ삼출성 중이염ㆍ역전사 중합효소 연쇄 반응.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Retention of inflammatory mediators and cells in the middle ear cleft results in ongoing inflammation and hearing loss in otitis media with effusion (OME). This study attempted to clarify the role of immune reaction during OME.
MATERIALS AND METHODS:
Immune-mediated OME was induced in rats, which were sensitized twice subcutaneously with KLH (keyhole lympet hemocyanine) and challenged with KLH into the middle ear 1 week later. We observed the development of MEE (middle ear effusion) after 1, 3, 5, 7 and 14 days following the challenge and utilized the RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction) technique to evaluate the presence of mRNAs for both TNF-alpha (tumor necrosis facor-alpha) and IL-10 (interleukin 10) in MEE. In addition, we examined the middle ear mucosa with a scanning electron microscope.
RESULTS:
Serous MEE developed within 3 or 5 days, and with time, it was changed to the mucoid type. We observed that mRNAs for both TNF-alpha and IL-10 were expressed in 87% of specimens. The expression rate of TNF-alpha mRNA and IL-10 mRNA were consitently high for all, from day 3 to day 14. Morphologic changes including loss, disorientation, aggregation and flattening of cilia began in the periphery of eustachian tube orifice at 3 days and with time the changes were aggravated. The shapes of cilia near the eustachian tube orifice began to be destroyed a little at 7 days but overall ciliary architecture was preserved untill 14 days.
CONCLUSION:
In the future, we will be able to apply the role of TNF-alpha and IL-10 in rat MEE to research on the pathogenesis, diagnosis and treatment in human OME.

Keywords: CytokineㆍImmune-mediatedㆍOtitis media with effusionㆍRT-PCR

서론 삼출성 중이염은 급성염증의 증상이나 증후없이 중이강에 저류액이 고이는 중이염의 일종으로 유소아에서의 가장 흔한 청력장애의 원인이 되고 있다. 이 질환의 병인으로는 급성 화농성 중이염, 이관기능의 장애, 알레르기, 세균감염, 국소적 면역반응 및 숙주인자 등이 있다.1) 삼출성 중이염은 저류액이 필수적으로 존재하며, 또한 저류액은 삼출성 중이염의 병인 및 병태에 대한 여러가지 정보를 제공하기 때문에 이에 대한 많은 생화학적 및 면역학적 연구가 시도되고 있다.2) 삼출성 중이염의 중이 저류액에서 발현되는 여러 cytokine들중 Tumor Necrosis Factor-α(TNF-α)는 삼출성 중이염의 초기에 발생하여 그 진행에 중요한 역할을 하는 염증매개체이며, Interleukin-10(IL-10)은 대식세포에 의한 TNF-α, IL-1 및 IL-12의 생산을 억제하는 것으로 알려져 왔다.3)4) Cytokine이 일반적으로 여러 질환에서 염증반응과 관련되어 있다는 보고들은 많으나5-7) 아직 삼출성 중이염에서의 cytokine 역할에 대한 연구는 그리 많지 않으며 임상에서 삼출성 중이염 환자의 중이저류액에서의 염증매개체와 중이점막에 대한 병리조직학적 연구 또한 현재까지도 매우 부족한 편이다. 이에 저자들은 세포성 면역을 유발시키는 물질로 밝혀진 Keyhole Limpet Hemocyanine(KLH)를 이용하여 흰쥐에서 실험적으로 삼출성 중이염을 유발시켜 그 중이저류액 내에 있는 대식세포를 포함한 염증세포가 가진 TNF-α 및 IL-10의 mRNA 발현을 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)으로 확인하고 동시에 중이점막의 변화를 주사전자현미경으로 관찰하여 삼출성 중이염의 발생과 진행에서 이들 cytokine의 역할을 밝히고자 본 연구를 시행하였다. 재료 및 방법 재료 실험동물 동일조건하에서 사육시킨 체중 150 g 내외의 건강한 흰쥐를 사용하였으며 수술현미경 하에서 외이도 및 중이의 질환이 없음을 확인하였다. 수술시 마취제로 ketamine(30 mg/kg), xylazine(6 mg/kg)을 근육 주사하였으며 필요에 따라 유지량으로 최초 용량의 반을 추가 주사하였다. 실험군의 분류 정상 대조군 2마리. 전신면역 대조군 KLH로 두 번에 걸친 전신면역 후 1, 3, 5, 7, 14일이 경과한 흰쥐 각각 2마리씩 총 10마리. 실험군 전신면역 후 우측고막을 통해 중이강내에 KLH를 추가주입한 후 1, 3, 5, 7, 14일이 경과한 흰쥐 각각 4마리씩 총 20마리를 실험군으로 하였으며, 좌측 귀의 중이강에는 K-LH 대신 인산완충식염수 20 μl를 주입하여 우측 귀에 KL-H를 주입한 것과 비교하였다. 항원(KLH)의 추출 KLH는 ammonium sulfate precipitate로써 Pacific Biomarine Laboratories(Venice, CA, USA)에서 구입하였다. KLH 현탁액을 투석막이 있는 튜브에 넣고 인산완충식염수(phospate buffered saline, PBS, pH 7.0) 800 ml에 담근 후 4℃에서 48시간 동안 방치하였다. 그후 KL-H를 4℃에서 3,500 rpm으로 30분간 원심분리한 후 pellet은 폐기하고 상층액을 다시 36,000 rpm으로 2시간 동안 원심 분리시켰다. 침전된 pellet을 인산완충식염수에 녹인 후 4℃에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 상층액을 정제된 KLH 항원으로 본 연구에 사용하였다. KLH 용액은 BCA protein assay kit(Pierce, USA)를 이용하여 농도를 측정한 후 실험에 사용할 때까지 4℃ 냉장고에 보관하였다. 방법 동물면역 전신면역은 KLH(20 mg/ml) 1 mg을 인산완충식염수 450 μl와 섞은 후 동량의 complete Freund’s adjuvant로 유화시켜 흰쥐의 등에 피하 주사하였다. 2주후 KLH(20 mg/ml) 1 mg을 인산완충식염수 450 μl와 섞은 후 동량의 incomplete Freund’s adjuvant로 유화시켜 흰쥐의 등에 2차로 피하 주사하였다. 중이강의 추가 국소면역은 2차 전신면역 1주일후에 KLH(20 mg/ml) 400 μg을 수술현미경하에서 자체 제작한 가는 유리관을 이용하여 고막을 통해 우측 중이강내로 주입하였고 좌측 중이강내로는 인산완충식염수 20 μl를 주입하였으며 천공된 고막은 gelfoam으로 막았다(Fig. 1). 중이저류액의 수집 마취상태에서 흰쥐의 후이개 부분을 절개하여 골포(bulla)를 노출시킨 후 그 첨부에 작은 구멍을 뚫어 인슐린 주사기로 중이저류액을 채취하였다. 그 다음 세포 배양액(R-PMI 1640, Gibco, Grand Island, NY, USA) 0.1 ml로 중 이강을 세척하여 하고실과 골포에 남아있는 중이저류액을 채취하여 Eppendorf tube에 담아 실험에 사용할 때까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 중이점막의 전자현미경학적 관찰 중이저류액을 수집한 후 헤파린으로 처리한 생리식염수와 4% paraformaldehyde(pH 7.4)로 심장관류를 통해 고정한 후 측두골을 절취하여 2.5% glutaraldehyde(pH 7.2)에 3∼4시간 추가 고정하였으며 1% osmium tetroxide로 90분간 후고정하였다. 고정이 끝난 표본은 탈수과정을 거쳐서 isoamyl acetate로 치환시켜 CO 2를 이용한 임계점 건조기(Polaron E 3000, USA)로 건조시켰고, 이온도금기(JFC 1100, Japan)로 금을 입힌후 주사전자 현미경(JSM 5410-LV, JEOL, Japan)으로 중이강내 이관개구부 입구와 그 주위 부분을 관찰하였다. 역전사 중합효소 연쇄반응 전체 RNA분리 중이저류액내 염증세포속의 전체 RNA는 Ultraspec TM-II RNA isolation system(Biotecx, USA)을 이용하여 분리되었다. 수집된 중이저류액 100∼300 μl에 1 ml Ultraspec TM-II RNA reagent을 넣어 vortex후 chloroform 0.2 ml를 넣고 원심분리를 시행하였다. 원심분리후 새 튜브에 옮긴 상층액에 isopropanol 250 μl와 RNA Tack TM Resin 25 μl를 혼합하고 잘 섞은 후 원심분리하여 상층액은 버리고 pellet은 75% 에탄올 1 ml로 2번 세척하고 diethyl pyrocarbonate(DEPC)로 처리한 증류수에 녹인 후 실험에 사용할 때까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다. cDNA 합성 Random hexamer법을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 추출된 전체 RNA 5 μl에 random hexamer(100 pmol/μl) 2 μl와 증류수 7.5 μl를 섞어 60℃에서 5분간 반응시킨후 15 mM dNTP 2 μl, murine leukemia virus reverse transcriptase(Boehringer Mannheim, Germany) 20 U, RNase inhibitor (50 U/μl) 0.5 μl, 5X reverse transcription buffer 4 μl와 섞어 37℃에서 1시간, 70℃에서 10분간 반응시킨 후 DEPC로 처리한 증류수 20 μl와 혼합하여 실험에 사용할 때까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다. 중합효소 연쇄반응 각각의 cytokine에 특이적인 primer는 한국생명공학에 의뢰하여 제작하였으며 그 primer의 염기서열은 Table 1에 표시하는 바와 같다. 합성된 cDNA 2.5 μl에 15mM dNTP 2.5 μl, paired primer(25 pmol/μl), Taq 중합효소(5 U/μl, Boehringer Mannheim, Germany) 0.5 μl, 10X PCR 완충액을 최종 50 μl되게 섞은 후 Thermal Cycler(Perkins-Elmer Corp. USA)을 이용하여 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 annealing, 72℃에서 1분간 extension하여 총 30회 시행하였다. 대조군으로는 β-actin(한국생명공학)을 사용하였다. 전기영동 1% agarose gel 제조용 완충액은 최종농도 0.5 μg/μl ethidium bromide를 혼합한 1X tris-boric acid-EDTA(TB-E) 완충액을 사용하였으며, PCR 반응물 7.5 μl와 100 base pair size marker 3 μl를 100V 직류하에서 1시간 동안 전기 영동한 후 260 nm 자외선하에서 사진으로 기록하였다. 결과 중이저류액의 발생 전신면역 대조군과 실험군의 인산완충식염수를 주입한 중이강내에서는 모두 중이저류액이 관찰되지 않았다. 중이강의 국소면역 후 3일째에 4귀중 3귀(75%)에서 장액성 중이저류액이 관찰되었으며, 5일째에 2귀(50%)에서 장액점액성 중이저류액이, 나머지 2귀(50%)에서 점액성 중이저류액이 관찰되었고, 7일째와 14일째에서는 각 4귀(100%) 모두에서 점액성 중이저류액이 관찰되었다(Table 2). 전신면역 대조군 및 수술 대조군의 중이강내에서는 모두 중이저류액이 관찰되지 않았다. Cytokine mRNA측정 중이저류액에서 면역반응과 관련이 있는 cytokine에 관한 mRNA의 발현을 RT-PCR 방법으로 측정한 결과에 의하면 삼출액의 종류에 따라 차이를 보였다. TNF-α mRNA는 장액성 중이저 류액 3귀중 3귀(100%), 장액점액성 중이저류액 2귀중 2귀(100%), 점액성 중이저류액 10귀 중 8귀(80%)로 전체적으로 87%로 나타났으며 IL-10은 장액성 중이저류액 3귀중 2귀(67%), 장액점액성 중이저류액 2귀중 2귀(100%), 점액성 중이저류액 10귀중 9귀(90%)로 전체적으 로 87%의 양성율을 보였다(Fig. 2, Table 3). 중이강의 국소면역 후 시간 경과에 따른 TNF-α mRNA의 발현율은 3일째 3귀의 중이저 류액에서 100%, 5일째 중이저류액에서 100%, 7일째 중이저류액에서 75%, 14일째 중이저류액에서 75%였으며 IL-10 mRNA의 발현율은 3일째 3귀의 중이저류액에서 75%, 5일째 중이저류액에서 100%, 7일째 중이저류액에서 100%, 14일째 중이저류액에서 75%를 보였다(Fig. 3). 전신면역 대조군 및 수술 대조군의 중이강을 세포배양액으로 세척한 후 실시한 RT-PCR에서 TNF-α나 IL-10의 mRNA는 발현되지 않았다. 중이점막의 주사전자현미경 소견 정상 대조군, 전신면역 대조군 및 수술 대조군의 주사전자현미경으로 관찰한 중이점막의 소견은 이관의 중이강 개구부 입구와 주변을 섬모세포가 대부분 차지하고 있었으며 섬모는 똑바로 서있는 모양을 보였고 전체 섬모의 방향은 이관 개구부쪽을 향하고 있었다(Fig. 4A and B). KLH를 중이강내 국소면역을 시행한 후 주사전자현미경으로 관찰한 중이점막의 변화로는 1일째에 이관의 중이강 개구부 주변과 입구의 섬모세포는 정상에서와 같은 섬모의 숫자나 모양이 유지되었다. 3일째에는 이관의 중이강 개구부 주변에 간헐적인 섬모세포의 감소를 보였으나 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향성은 유지되었으며 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모세포는 정상과 비슷한 소견이 관찰되었다(Fig. 5A and B). 5일째에는 이관의 중이강 개구부 주변에 섬모세포의 감소나 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향성은 3일째 이관의 중이강 개구부 주변과 비슷한 소견을 보였으며 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모세포는 정상과 비슷한 소견이 관찰되었다. 7일째에는 이관의 중이강 개구부 주변의 섬모세포의 감소는 5일째보다 좀더 심해졌으며 융합된 섬모의 모양이 간헐적으로 관찰되었고 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실이 나타나기 시작했으며 대부분의 섬모는 편평한 모양을 보였고 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모세포는 정상에 비해 다소 감소하였으나 섬모의 방향상실 및 융합은 미약했으며 일부 섬모는 편평한 모양을 보였다(Fig. 6A and B). 14일째에는 이관의 중이강 개구부 주변에 섬모세포의 감소, 융합, 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실이 가장 심했으며 대부분의 섬모는 편평한 모양을 보였다. 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모세포는 7일째 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모세포에 비해 섬모세포의 감소, 섬모의 융합, 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실은 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 7A and B). 고찰 삼출성 중이염은 이과 질환에서 가장 흔히 볼 수 있는 중이염증의 하나로 중이강내 여러 형태의 저류액의 생성과 난청을 동반하는 질환이다. 삼출성 중이염를 일으키는 것에는 이관기능장애, 알레르기, 바이러스, 세균, 숙주인자 그리고 염증 매개체 및 염증반응 산물 등의 생화학적 인자들이 복합적으로 작용한다.1) 삼출성 중이염에서는 저류액이 필수적으로 존재하며 중이저류액 내에는 염증을 방어하는데 관여하는 이로운 물질도 존재하지만 히스타민, 프로스타글란딘, 단백질 분해효소, 활성화된 보체, 아라키돈산 대사물, 류마티스양 인자 및 면역복합체 등과 같은 해로운 물질도 존재한다.8) 이들 물질들은 만성화되는 삼출성 중이염의 병인에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 삼출성 중이염에 있어서의 cytokine에 대한 연구로는 Howie 등9)이 삼출성 중이염에서 interferon의 활성도를 측정한 이후 Catanzaro 등10)이 IL-2와 TNF를 기니픽의 중이강에 주사하여 실험적으로 삼출성 중이염을 유발시켰으며, Johnson 등1)은 세균에 의해 Chinchilla에서 유발된 중이저류액에서 IL-1β, TNF-α의 검출을 보고하였고, 사람의 중이저류액에서 Maxwell 등11)이 IL-1β, TNF-α, IL-8을, Yellon 등12)13)이 TNF-α, INF-γ, IL-1β, IL-6 등의 검출을 보고하였다. 그러나 삼출성 중이염에서 염증에 관여하는 cytokine 등의 검출이 보고자나 정량방법에 따라 차이가 있으며, 삼출성 중이염 환자의 중이저류액에서의 염증 매개체와 사람의 중이점막에 대한 병리조직학적 연구는 매우 어렵기 때문에 동물모델에 의한 연구가 많이 시행되고 있다. 실험동물에서 삼출성 중이염을 일으키는 방법으로는 이관 폐쇄, 내독소의 중이강내 접종, 중이저류액의 중이강내 주입, 면역반응에 의한 것 등이 있다.8) 삼출성 중이염 연구에 있어 동물모델은 외과적 처치가 용이하고, 개체간의 변이를 조절할 수 있으며, 병원체를 접종할 수 있고, 시간경과에 따른 병리학적 진행을 조사하기 쉬운 장점이 있다.1) 정상 중이강내의 점막에는 림프조직이 없고, 상주하는 백혈구도 매우 적지만 항원에 대한 면역반응이 활발하고 말초혈액으로부터 림프구의 유입도 잘 일어나므로14) 이를 이용하여 저자들은 세포성 면역을 유발시키는 물질로 알려진 KLH를 이용하여 흰쥐에서 아직까지 국내에서는 보고가 없는 실험적으로 삼출성 중이염을 유발시켜 삼출성 중이염의 병인을 밝히고자 하였다. 본 연구에서 중이저류액은 KLH로 중이강의 국소면역후 3일째에 장액성 삼출액이 4귀중 3귀(75%)에서, 5일째에 장액점액성 삼출액이 4귀중 2귀(50%), 나머지 2귀(50%)에서 점액성 삼출액을 보였는데 이는 Nakata등8)이 기니픽에서 KLH 추가면역후 4일째에 장액성 삼출액이 100%에서 발생한 것과 비슷한 결과를 얻었다. 중이저류액에서 염증 매개체의 발현을 증명하는 방법으로는 Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)와 Radioimmunoassay(RIA) 등이 널리 이용되어 왔으나1)11) 최근 분자생물학적인 기법의 발달로 좀더 근원적인 수준에서의 염증 매개체의 존재를 알아내려는 노력이 제시되고 있다. 역전사 중합효소 연쇄반응은 표본간의 mRNA의 상대적인 양을 비교하는 데에는 제한이 있기는 하지만 적은 수의 세포에 있는 많은 종류의 cytokine 유전자나 적은 양의 RNA의 전사를 연구하거나 거의 발현이 안되는 cytokine mRNA를 알아내는데 매우 예민한 방법이다.15) 중이저류액을 대상으로 감수성과 특이성 측면에서 가장 정확한 역전사 중합효소 연쇄반응기법을 사용하여 염증반응 관련 cytokine등의 mRNA발현을 측정하였다. TNF-α에 대한 측정 결과는 본 실험에서 장액성, 장액점액성 중이저류액에서 100%, 점액성 중이저류액에서 80%로 전체적으로는 87%로 나타났으며 실험대상이 다르긴 하지만 Yellon 등 12)과 Maxwell 등11)이 사람의 중이저류액에서 ELISA를 이용하여 측정한 결과는 각각 63%, 77%였다. 이것은 실험대상과 실험방법이 다르기 때문일 것이다. 장액점액성 및 점액성 중이저류액에서 cytokine의 발현율이 높게 나타나는 것으로 보아 만성화된 삼출성 중이염에서 중이강내로 모여진 염증세포로부터 각각의 cytokine에 대한 유전자 발현이 지속적으로 유도되어 mRNA가 생성되는 것으로 보여진다. TNF-α는 세균의 리포다당질이나 바이러스의 자극에 의해 활성화된 대식세포나 림프구에 의해 분비되어 섬유모세포를 증식시키고 종양의 혈관성 괴사를 유발하며 중성구를 활성화시키고 혈관 내피세포의 증식을 억제하며 연골 및 뼈의 흡수를 촉진하고 항체생성을 억제하며 IL-1, IL-2, IL-6, 콜라게나아제, 프로스타글란딘 E2의 생성을 유발시키는 역할을 한다.11) IL-10은 주로 T-helper(Th2) 세포에 의해 분비되며 활성화된 대식세포에서도 분비된다. IL-10의 기능은 대식세포에 의한 TNF-α, IL-1, IL-12의 생산을 억제하며 class II 분자나 B7과 같은 costimulator의 발현을 억제하고 T 림프구 매개성 면역반응을 억제한다. 또한 B 림프구에 작용하여 항체의 생성을 촉진시키기도 한다.16) 이와 같이 다양한 기능을 가진 IL-10은 일반적으로 T 임파구나 대식세포에서 cytokine 생성을 억제하는 인자로 알려져 있으며3) 동물이나 사람의 중이저류액에서 IL-10의 발현에 대한 보고는 현재 없는 상태이다. TNF-α와 IL-10의 상호관계에 대한 Wanidworanum 등4)의 실험에서 TNF-α에 의해 유발된 IL-10은 다시 TNF-α나 IL-10의 발현을 하향 조정한다고 하였다. TNF-α가 IL-10의 생성을 유발하는 기전에는 첫째 TNF-α가 직접 IL-10 mRNA 전사에 영향을 미치거나, 둘째 TNF-α가 IL-1α, IL-1β, IL-6 및 interferon γ 등과 같은 cytokine을 유발하고 이들 cytok-ine 등이 IL-10을 유발시키며, 세째 TNF-α가 IL-10 m-RNA 자체를 안정화시킨다는 것 등이 있는데4) RT-PCR 기법을 사용한 본 실험에서 시간적 경과에 따른 TNF-α mRNA와 IL-10 mRNA의 발현을 정량적으로 비교할 수는 없었으므로 향후 삼출성 중이염에서 IL-10과 TNF-α와의 상호작용을 명확하게 밝히기 위해서는 중이저류액에서 quantitative PCR이나 ELISA 등을 이용하여 이들 cytokine 발현에 대한 비교를 시도해 보는 것이 좋으리라 생각된다. 중이의 점막은 주로 단순 편평상피와 일부 배상세포로 구성되어 있으며 이관의 중이 개구부 주위에는 80%가 섬모상피로 이루어져 있다. 이 섬모상피는 중이강내 저류액의 배출에 중요하며 중이강내에 염증이 발생할때 이 섬모운동의 기능저하로 이차적인 세균감염을 일으키기 쉽게 한다.17) 사람과 Chincilla의 삼출성 중이염에서 중이강내 조직학적 변화로는 상피증식, 배상 세포수 증가, 상피하조직의 비후, 중성구의 침윤, 혈관분포의 증식, 골의 개형 등이 관찰되었다.1) 본 연구에서 중이강의 국소면역후 주사전자현미경으로 관찰한 중이점막의 섬모세포의 상태는 전체적으로 섬모세포의 감소, 섬모의 요곡, 융합 및 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실을 보였으며 매우 심한 염증반응이 발생할 때까지 중이강내 이관 개구부 입구의 섬모세포는 섬모세포의 감소, 섬모의 요곡, 응집 및 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실 등의 변형을 보였으나 그 정도는 이관 개구부 주변의 섬모세포의 변형에 비해 미약하였다. 이는 Suzuki 등18)과 Catanzaro 등19)이 KLH를 이용하여 실험적으로 유발한 삼출성 중이염 동물의 중이점막 변화와 일치한다. 중이염증에 중요한 염증 매개체의 역할을 하는 cytokine mRNA의 발현과 중이점막의 주사전자현미경적 소견을 비교했을때 중이강의 국소면역후 7일째에 TNF-α mRNA보다 IL-10 mRNA의 발현이 높았음에도 불구하고 섬모세포의 감소 및 섬모의 변형이 5일째 보다 더 심한 것으로 보아 염증 매개체의 발현과 이들에 의한 중이점막의 반응에는 시간적인 차이가 있는 것으로 생각된다. 중이강내 염증에 의한 섬모의 기능 저하는 중이저류액의 배출에 지장을 초래하며 중이저류액내의 여러 염증 매개체가 중이강내에 장기간 존재하게 되어 염증을 더욱 악화시킨다. 삼출성 중이염의 병인에 있어 이관기능은 매우 중요하며 이관기능부전은 염증에 의해 이차적으로 또는 이관의 기계적 폐쇄 및 이관 자체의 염증에 의해 생길 수 있다. 본 실험에서 이관 자체의 폐쇄 혹은 염증이 없이도 중이강내의 면역학적인 반응에 의해 발생한 염증에 의해 이관기능부전이 생길 수 있으며 이것이 삼출성 중이염의 만성화에 기여하는 것으로 생각된다. 이상의 결과로 KLH를 이용하여 흰쥐에서 면역 매개성 삼출성 중이염을 유발시킬 수 있었으며 이때의 중이점막의 섬모세포의 변화로 사람의 삼출성 중이염에서 나타나는 섬모세포의 감소, 섬모의 융합 및 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실 등을 관찰할 수 있었으며 이로 인한 이관기능부전은 삼출성 중이염의 만성화에 기여할 것으로 생각된다. 중이저류액에서 염증의 초기에 발생하여 그 진행에 중요한 염증 매개체의 역할을 하는 TNF-α와 IL-10의 발현율이 높으므로 향후 사람의 삼출성 중이염을 치료하는 데에 임상적인 적용을 시도해 볼 수 있으며 KLH에 의한 삼출성 중이염 동물모델이 사람의 삼출성 중이염의 병인을 규명하기 위한 연구에 활용될 수 있으리라 생각된다. 결론 저자들은 삼출성 중이염의 발생에 대한 면역학적 역할을 규명하기 위해 세포성 면역을 유발시키는 물질로 알려진 KLH를 이용하여 흰쥐에서 삼출성 중이염을 유발시키고 그 결과 발생한 중이저류액에서 역전사 중합효소 연쇄반응기법을 이용하여 TNF-α와 IL-10의 mRNA발현율을 확인하고 중이강내 위치에 따른 중이점막의 병리조직학적 변화와의 관계를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1) KLH로 중이강의 국소면역 후 3일째에 4귀중 3귀에서 장액성의 삼출액이 관찰되었으며 5일째에 2귀에서 장액점액성의 삼출액이, 2귀에서 점액성의 삼출액이 관찰되었고 7일째와 14일째에서는 각 4귀 모두에서 점액성의 삼출액이 관찰되었다. 2) TNF-α는 장액성, 장액점액성 중이저류액의 100%에서, 점액성 중이저류액의 80%에서 전체적으로는 87%에서 나타났으며 IL-10은 장액성 중이저류액의 67%에서, 장액점액성 중이저류액의 100%에서 점액성 중이저류액의 90%에서 전체적으로 87%의 양성율을 보였다. 중이강의 국소면역후 TNF-α와 IL-10의 mRNA의 발현율은 3일째부터 14일째까지 지속적으로 높게 나타났다. 3) KLH로 중이강의 국소면역후 주사전자현미경으로 관찰한 중이점막의 변화로는 1일째에 이관의 중이강 개구부 주변과 입구의 섬모세포의 섬모는 정상에서와 같이 똑바로 서있는 모양을 보였고 이관개구부쪽으로의 방향성도 유지하였으나 3일째부터 이관의 중이강 개구부 주변에 간헐적인 섬모세포의 감소를 보였으며 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모세포는 정상과 비슷한 소견을 보였다. 5일째에는 3일째 소견과 큰 차이를 보이지 않았으나 7일째에 이관의 중이강 개구부 주변의 섬모세포의 감소가 심해졌으며 간헐적인 섬모의 융합이나 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실이 나타나기 시작했고 대부분의 섬모는 편평한 모양을 보였으나 이관의 중이강 개구부 입구에서는 섬모세포의 감소, 섬모의 융합 및 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실이 약하게 나타났으며 일부 섬모에서 편평한 모양을 보였다. 14일째에 이관의 중이강 개구부 주변의 섬모세포의 감소, 섬모의 융합 및 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실이 가장 심했고 대부분의 섬모는 편평한 모양을 보였으나 이관의 중이강 개구부 입구의 섬모상피는 7일째의 섬모상피와 큰 차이를 보이지 않았다. 이상의 결과를 종합하면 KLH를 이용하여 흰쥐에서 면역 매개성 삼출성 중이염을 유발시킬 수 있었으며 이때의 중이점막의 섬모세포의 변화로 사람의 삼출성 중이염에서 나타나는 섬모세포의 감소, 섬모의 융합 및 이관의 중이강 개구부쪽으로의 섬모의 방향상실 등이 관찰되었다. 중이저류액에서 염증의 초기에 발생하여 그 진행에 중요한 염증 매개체의 역할을 하는 TNF-α와 IL-10은 향후 사람에서 삼출성 중이염의 병인에 대한 연구와 임상적 진단 및 치료에 응용할 수 있으리라 생각된다.
REFERENCES
1) Johnson MD, Fitzgerald JE, Leonard G, Burleson JA, Kreutzer DL. Cytokine in experimental otitis media with effusion. Laryngoscope 1994;104:191-6. 2) Lim DJ, Bluestone CD. Recent advances in otitis media. Ann Otol Rhinol Laryngol 1994;103 Suppl 164:1-80. 3) Wang P, Wu P, Siegel MI, Egan RW, Billah MM. IL-10 inhibits transcription of cytokine gene in human peripheral blood mononuclear cells. J Immunol 1994;153:811-6. 4) Wanidworanum C, Strober W. Predominant role of tumor necrosis factor-α in human monocyte IL-10 synthesis. J Immunol 1993;151:6853-61. 5) Saito R, Prehn J, Zuo XJ, Marchevesky A, Castracane P, Waters P, et al. The participation of tumor necrosis factor in the pathogenesis of lung allograft rejection in the rat. Transplantation 1993;55:967-72. 6) Matsuda S, Uchikawa R, Yamada M, Arizono N. Cytokine mRNA expression profile in rats infected with the intestinal nematode nippostrongylus brasiliensis. Infection and Immunity 1995;63:4653-60. 7) Josien R, Pannetier C, Douillard P, Cantarovich D, Menoret S, Bugeon L, et al. Graft-infiltrating T helper cells, CD45RC phenotype, and TH1 / TH2-related cytokines in donor-specific transfusion-induced tolerance in adult rats. Transplantation 1995;60:1131-9. 8) Nakata J, Suzuki M, Kawauchi H, Mogi G. Experimental otitis media with effusion induced by middle ear effusion. Laryngoscope 1992;102:1037-42. 9) Howie V, Pollard R, Kleyn K, Lawrence B, Peskuric T, Paucker K, et al. Presence of interferon during bacterial otitis media. J Infect Dis 1982;145:811-4. 10) Catanzaro A, Ryan AF, Batcher S, Wasserman SI. The response to human rIL-1, rIL-2, and rTNF in the middle ear of guinea pigs. Laryngoscope 1991;101:271-5. 11) Maxwell KS, Fitzgerald JE, Burleson JA, Leonard G, Carpenter R, Kreutzer DL. Interleukin-8 expression in otitis media. Laryngoscope 1994;104:989-95. 12) Yellon RF, Leonard G, Marucha PT, Craven R, Crapenter RJ, Lehmann WB, et al. Characterization of cytokines present in middle ear effusions. Laryngoscope 1991;101:165-9. 13) Yellon RF, Leonard G, Marucha PT, Sidman J, Carpenter R, Burleson J, et al. Demonstration of interleukin 6 in middle ear effusions. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1992;118:745-8. 14) Bikhazi P, Ryan AF. Expression of immunoregulatory cytokines during acute and chronic middle ear immune response. Laryngoscope 1995;105:629-34. 15) Han CW, Imamura M, Zhu X, Tanaka J, Sakurada K, Asano S, et al. The immunosuppressants, FK506 and KM2210 (a conjugate of estradiol and chlorambucil) modulated transcription of various cytokine genes in unstimulated normal murine bone marrow and spleen cells: Suggestion of their positive effects on hematopoiesis and induction of immune tolerance. Korean J BRM 1996;6:57-68. 16) Abbas AK, Lichtman AH, Pober JS. Cellular and molecular immunology. In: Cytokines. 2nd ed. Philadelphia: Saunders;1994. p.239-60. 17) Lim DJ. Scaning electronmicroscopic morphology of the ear. In: Paparella MM, Shumrick DA, Gluckman JL, Meyerhoff WL, Editors: Otolaryngology. 3rd ed. Philadelphia: Saunders;1991. p.459-94. 18) Suzuki M, Kawauchi H, Mogi G. Immune-mediated otitis media with effusion. Am J Otolaryngol 1988;9:199-209. 19) Catanzaro A, Ryan AF, Robb JA. Immunologically mediated and nonspecific inflammatory responses in the middle ear. Clinic Immunol & Immunopathol 1982;24:361-76.