| Polysomy of Chromosome 17 Predicting Treatment Failure in Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. |
| Sung Won Chae, Geon Choi Jong, Ouck Choi, Kwang Yoon Jung, Yong Hwan Kim, Soon Jae Hwang |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. kughorl@nuri.net |
| 두경부 편평세포암종에서 치료 실패와 제17번 다염색체 소견의 의의 |
| 채성원 · 최 건 · 최종욱 · 정광윤 · 김용환 · 황순재 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
다염색체ㆍ염색체 17번ㆍ두경부ㆍ편평세포암종. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The two major biologically distinct patterns of treatment failure following definitive therapy for the patients with head and neck squamous cell carcinoma are the recurrence of primary tumor and the development of second primary tumor. The purpose of this study is to determine whether the polysomy of chromosome 17 has prognostic significance and is associated with the pattern of treatment failure.
MATERIAL AND METHODS: We performed nonfluorescent, nonisotopic, in situ hybridization using chromosome-specific centrometric DNA probe for chromosome 17 on formalin-fixed, paraffin-embedded specimens from the tumor tissue and the resection margins of 42 head and neck squamous cell carcinomas were treated with definitive local therapy.
RESULTS:
In the tumor tissue, the polysomy of chromosome 17 was a significant predictor for recurrence and treatment failure. In the resection margins, the polysomy of chromosome 17 also showed a predictive significance for the treatment failure. Although there was a chromosomal change in the resection margins believed to be negative on light microscopy, it was also related to the treatment failure.
CONCLUSION:
The polysomy of chromosome 17 may be a valuable marker for identifying individuals who have the high risk of developing recurrence and treatment failure. |
| Keywords:
PolysomyㆍChromosome 17ㆍHead neckㆍSquamous cell carcinoma |
서론
지난 20년간 수술치료, 방사선치료, 화학요법의 발전에도 불구하고 두경부 편평세포암종 환자의 장기 생존률은 크게 개선되지 않았다.1) 두경부암 환자에서 적극적으로 치료한 후에도 치료가 실패하는 이유는 첫째로 치료 후에도 원발암이 잔존하여 재발하는 국소재발, 경부재발 및 원격전이가 발생하는 것과 둘째로는 적극적인 치료로 인체내의 암세포가 완전히 제거되어도 타 부위 점막에서 새로운 종양이 발생하는 이차암의 발생으로 나눌 수 있다. 또한 이차암의 발생은 장기 생존률이 저하되는 주된 이유가 되고 있다.
두경부에 발생하는 편평세포암종은 상부 기식도관(upper aerodigestive tract)의 점막이 술과 담배와 같은 발암물질에 반복적으로 노출되어 유전자 또는 염색체의 변화가 축적되어 발생되는 것으로 알려져 있다. 한편 악성 종양 외에도 악성 종양 주변 조직도 발암물질에 같이 노출되어 유전자 또는 염색체 변화가 동반되는 것으로 밝혀졌고, 이러한 이유로 이차암 또는 다발암이 흔히 동반하게 되며 이 개념을 영역암 발생(field cancerization)이라 한다.2) 최근에는 두경부 편평세포암종 환자에서 원발 부위에서 변형된 클론(transformed clone)이 점막하 또는 타액에 의해 타 부위로 퍼져 암으로 발전하며 이로 인하여 적극적인 치료 후에도 이차암 또는 국소재발이 흔하다는 클론확산(clonal extension) 이론도 제시되고 있다.3)
두경부 편평세포암종에서 치료 실패의 가능성을 예측할 수 있는 표지자는 수술적 치료 후 이차암 또는 국소재발의 가능성이 높은 환자를 선별할 수 있게 하고 이들에게 보다 적극적인 치료를 함으로써 치료율을 높이는데 중요한 역할을 한다. 이러한 표지자는 형태학적 변화 이전의 유전자적 변화를 간편한 방법으로 찾을 수 있어야 하지만 현재까지 적절한 방법이 없다. 유전자 또는 염색체 변화가 정상 점막에서도 존재할 가능성이 있어 형태학적으로 정상인 두경부암 주위 점막에서 염색체의 변화를 찾는다면 고위험군을 선별할 수 있는 표지자로서의 가치를 확인할 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 표지자를 통하여 예후를 예측하고 이에 대비하려는 시도로서 종양 발생과 진행 과정에서 있어 일련의 유전적 변화를 밝히고 이에 따른 예후와 유전적 변화 사이의 상관 관계를 찾고자 하고 있다.5)6)
염색체 변화를 확인하는 방법으로 non-isotope in situ hybridization(NISH)이 개발되었으며, 이는 다양한 종류의 특정 염색체에 특수한 표적이 되는 반복성 DNA 배열 순서나 전체 혹은 일부 염색체 절편의 배열 순서를 인지하는 DNA probe들이 개발되어 세포분열 중기(metaphase)에서만 분석이 가능하였던 핵형 분석(karyotyping)과 달리 간기(metaphase) 핵에서도 염색체의 수적, 구조적 이상을 확인할 수 있게 되었다.8) 최근 Choi와 Chung은 종양 조직, 절제연과 종양에서 떨어진 점막에서 in situ hybridization(ISH)을 이용하여 종양의 절제연에서 제7번과 제17번 다염색체 소견이 종양과 떨진 점막에 비하여 증가함을 보고하여,8) 이러한 절제연의 다염색체 소견은 국소재발이나 이차암의 예견 지표로서 가치가 있을 가능성을 제시하였다. 또한 제7번과 17번 다염색체 소견의 분포 양상이 일치하는 결과를 보고하여 이 연구에서는 제17번 다염색체 소견만을 확인하였다.
본 연구의 목적은 제17번 염색체의 중심절 부위의 DNA 배열순을 인지하는 반복성 alpha-satellite DNA probe로 ISH를 시행하여 수술을 시행한 두경부 편평세포암종의 종양 조직 및 절제연에서 제17번 다염색체 소견을 검색하고, 이들 환자의 추적 관찰에서 재발, 이차암 발생 등 치료 실패의 발생 여부를 비교하여, 절제연의 제17번 다염색체 소견의 존재 여부가 재발 및 이차암의 발생을 포함한 치료 실패를 예견하는 표지자로서의 가치를 찾는데 있다.
대상 및 방법
대상 환자의 임상 소견
1993년 1월부터 두경부 편평세포암종으로 진단받고 우선적으로 수술적 치료를 받은 환자 중 병리조직학적으로 절제연이 정상이고 3년 이상 추적 관찰이 가능하였던 환자를 대상으로 하였다.
수술시 적출한 병리조직 표본과 환자의 기록을 확인하였다. 환자의 성별, 연령, 원발 부위, 원발 병소의 병기(T1-T4), 경부전이병기(N0-N3), American Joint Committee on Cancer(AJCC, 1997)9) 병기, 종양의 분화도, 치료방법 및 추적 관찰 결과를 확인하였다. 국소재발 혹은 경부재발 여부 및 이차암 발생을 추적 관찰하였다.
대상환자는 총 42예로 남자 37예, 여자 5예이었으며, 연령 분포는 21세에서 83세로 중앙값은 60세이었다. 종양의 부위별 분포는 구강 12예, 구인두 2예, 하인두 9예 그리고 후두 19예이었다. AJCC에 따른 병기 분포는 I기 3예, II기 15예, III기 10예, IV기 14예이었다.
재료
광학 현미경하에서 병리조직 슬라이드를 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin) 염색으로 검사하여 종양 조직과 병리조직학적으로 정상이며 종양 조직과 1 cm 이상 이격된 절제연을 선택하였다.
제17번 다염색체의 확인법
절편 제작
절편제작은 조직을 각각 포르말린에 고정하고 파라핀으로 포매하여 4 μm의 두께로 절편을 만들고 ProbeOn Plus slide(Fisher Scientific, USA)에 흡착시켜 실온에 보관하였다.
하이브리드 전처치
하이브리드 전처치는 슬라이드를 65℃ 오븐에 하룻밤을 두어 조직을 슬라이드에 밀착시키고 다음날 조직 절편이 붙은 슬라이드를 실렌(xylene)에 10분씩 3회 처리하여 파라핀을 제거한 후 100% 에탄올에 10분씩 2회 처리하여 탈수시키고 슬라이드를 공기 중에 건조하였다. 세포질과 핵단백의 제거는 0.2 N HCl이 포함된 0.4% 펩신용액(Sigma, USA)에 4℃에서 15분간, 37℃에서 45분간 처리하고 세포질과 핵단백 제거 정도는 광학현미경으로 관찰하였다. 그 후 증류수로 3분간 3회 씻어 반응을 중지시키고 70%, 90%, 100% 계열 에탄올로 탈수를 하고 공기에 건조시킨 후 아세톤에 2분간 고정하였다. 내인성 과산화효소(peroxidase)의 차단은 3% 과산화수소수가 포함된 90% 메탄올에 실온에서 5분간 처치하였다. 2x SSC(standard sodium citrate solution, 0.3 mM sodium citrate, pH7.0, 이후 SSC로 약함)로 3분간 3회 세척 후 다시 계열 에탄올로 탈수하여 공기에 건조하였다.
ISH
DNA probe(Oncor, USA)는 비오틴(biotin)이 부착된 제17번 염색체의 중심절 부위(peri-centromeric region)의 반복성 alpha-satellite DNA probe를 사용하였다. 65% formamide와 2x SSC가 혼합되어 있는 Oncor Hybrisol VI(Oncor, USA) 30 μl에 DNA probe 1.5 μl를 섞어 만든 하이브리드결합 혼합물을 조직에 점적하고 덮개유리를 덮은 후 고무풀로 주변을 봉하였다. 이 슬라이드를 90℃ 오븐에 12분간 두어 조직 절편내의 표적 DNA와 DNA probe를 동시에 변성시켰다. 37℃ 배양기에서 16시간 동안 하이브리드결합을 시행한 후 50% formamide와 2x SSC(pH 7.0)로 하이브리드 결합이 되지 않은 DNA probe를 씻어내기 위해 실온에서 15분씩 두번 세척하고 0.1x SSC로 37℃ 진탕 수조(shaking water bath)에서 10분간 세번 더 세척하였다.
효소 증폭은 60 μl avidin(Oncor, USA)을 슬라이드에 놓고 프라스틱 덮개로 덮고 실온에서 20분간 반응시킨 후 1x 인산완충액(phosphate-buffered saline, pH7.4)으로 실온에서 2분간 3회 세척하였다. 60 μl biotin/antiavidin antibody(Oncor, USA)를 조직에 가하여 프라스틱 덮개를 덮고 실온에서 20분간 반응시킨 후 1x 인산완충액으로 실온에서 2분간 3회 세척하였다. 60 μl의 horse reddish peroxidase/streptavidine(Oncor, USA)을 슬라이드에 점적하고 프라스틱 덮개를 덮고 37℃ 수조에서 30분간 반응시킨 후 증류수로 2분간 3회 세척하였다.
염색
염색은 diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB) 용액(Oncor, USA)을 사용하여 10분간 실온에 두어 염색하고 1x 인산완충액에 2분간 3회 그리고 흐르는 증류수에 30초간 세척하였다. 대조염색은 Wright 염색(Oncor, USA)을 사용하여 슬라이드에 5분간 대조염색 후 흐르는 증류수로 세척하고 광학현미경(Olympus BH-2, Japan)으로 관찰하여 대조염색의 강도를 확인하였다. 염색이 적당하지 않을 경우에는 대조염색을 더하거나 세척을 더 시행하여 적당한 강도라고 판단될 경우에 실렌에 처리하여 봉입하였다.
결과 판정
ISH 신호의 검색은 종양 조직내 침윤된 림프구 또는 점막하의 림프구를 내부 대조로 사용하였고, 전체적으로 200 배의 현미경 시야에서 거의 모든 세포의 핵에서 반응이 보일 경우, 즉 80∼90% 이상의 거의 모든 세포의 핵에서 신호가 고루 나타나야만 실험의 성공으로 판정하고 그렇지 못한 경우에는 실험을 다시 실시하였다. ISH 신호의 검색은 Hopman 등10)과 유사한 방법을 사용하여 종양 세포일 경우 슬라이드 당 400개 이상의 핵을, 정상 세포인 경우 200개 이상의 핵을 세었다. 신호의 수를 세는 방법은 신호들이 붙어 있을 때, 즉 쌍으로 존재하거나 갈라졌을 경우는 하나로 세었으며 미세한 신호와 같은 비특이적 신호는 제외하였다. 제17번 다염색체 소견은 한 개의 핵 내에 3개 이상의 신호가 나타나는 경우로 하였다.
다염색체 소견에 따른 절단점(Cutoff point)의 설정
예후에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다염색체 소견의 백분율에 따라 다염색체 양성군과 음성군으로 나누고 이를 환자의 치료 실패와 비교하였다. 표지자의 발현 결과를 가장 유의하게 사용하기 위하여 절단점은 결과를 변화시키지 않는 범주 내에서 값이 클수록 유리하여, 불량한 예후를 보이는 p값으로는 종양 조직의 경우 절단점을 10% 혹은 그 이상인 경우로 정하였다(Cutoff point 1%, p<0.001, 5%, p<0.001, 10%, p<0.001). 15% 이상의 백분율로 절단점을 정하였을 경우 p값이 0.002이 되며 그 이상인 경우 통계학적으로 유의하지 않았다. 절제연의 경우 같은 방법으로 절단점을 3%로 정하였다(p<0.001). 절제연의 경우 세포의 3% 이상에서 제17번 다염색체 신호가 관찰되는 경우를 양성군으로, 그 이하인 경우를 음성군으로 나누고 재발, 이차암의 발생 및 치료 실패 여부 등의 분석을 실시하였다.
통계학적 분석
종양의 재발 기간은 수술 후부터 재발이 발견될 때까지의 기간으로 하였다. 이차암의 발생 기간은 치료 시작부터 이차암 발견까지의 기간으로 하였다. 치료 실패 기간은 치료 시작으로부터 이차암의 발견 또는 종양의 재발까지의 기간으로 하였다.
다염색체 소견에 따른 각 환자군의 특성은 단변량분산분석(univariate analysis)에 의하여 비교하였다. 다염색체 소견, 성별, 연령(60세 미만, 60세 이상), T분류(T1, T2 대 T3, T4), N분류(N0 대 N1-3), AJCC분류(I, II 대 III, IV), 종양의 원발 부위(구강, 구인두, 후두, 하인두)와 종양의 병리조직학적 분화도(고분화, 중등도분화)의 p값은 two-sided Fisher’s exact test로 분할표(contigency table)에 의하여 산출하였고 치료 실패율은 two-sided log rank test도 함께 사용하였다. 유의수준은 95%로 정하였다. 재발율, 이차암 발생율과 치료 실패율은 제17번 다염색체 소견 유무에 따라 two-sided Fisher’s exact test로 비교하였으며, 치료 실패 기간에 따른 비교는 Kaplan Meier 방법에 따라 산출하였다.
결과
제17번 다염색체 여부에 따른 환자의 특성
대상 환자를 제17번 다염색체 양성군과 음성군을 분류한 이후 연구 대상의 임상적, 병리조직학적 차이가 발생하여 결과가 변형되는 경우를 배제하기 위하여 환자의 성별, 나이, T 분류, N 분류, AJCC 분류, 원발 부위, 종양의 병리조직학적 분화도와 치료방법에 따라 양군간에 차이가 없음을 확인하였다. 종양 조직에서 다염색체 양성군과 음성군으로 분류된 두 군은 경부 림프절 전이 여부(p＝0.047)를 제외하고는 유의한 차이가 없었다(Table 1). 절제연에서의 두 군은 비교한 모든 요소에서 유의한 차이가 없었다(Table 2).
종양 조직과 절제연에서 제17번 다염색체 소견
종양 조직과 절제연에서 다염색체 소견은 종양 조직의 경우 절제연보다 다염색체 소견이 많았다(p<0.001)(Table 3). 전체 42예의 조직 표본에서 종양 조직의 경우 세포핵의 1% 이상에서 다염색체 소견이 있는 예는 38예(90.5%)이었으며, 5% 이상된 예는 34예(80.9%), 10% 이상은 22예(52.4%), 50% 이상은 8예(15.3%)이었다. 절제연에서 다염색체 소견은 1% 이상 31예(73.9%), 2% 이상 22예(52.3%), 3% 이상 21예(50.0%), 5% 이상 3예(7.1%)이었다(Table 4, Figs. 1 and 2).
다염색체 소견과 예후
다염색체 소견과 재발
종양 조직의 다염색체 소견에 의하여 다염색체 양성군의 22예 중 12예(54.5%)에서 다염색체 음성군 20예 중 3예(15%)에서 종양이 재발되어, 다염색체 소견 양성의 경우 음성군에 비하여 재발이 많았다(p＝0.011). 이차암 발생은 4예에서 발생하였으며 3예는 다염색체 양성군에서, 1예는 음성군에서 발생하였으나 다염색체 소견에 따른 통계학적 차이는 없었다(p＝0.608). 재발과 이차암 발생을 포함하는 치료 실패한 예는 다염색체 양성군의 15예(68.2%)에서 다염색체 음성군 4예(20%)에서 발생하여 다염색체 양성군에서 치료 실패가 많았다(p＝0.002)(Table 5).
절제연의 다염색체 소견에 의한 재발은 다염색체 양성군 10예(47.6%)에서, 다염색체 음성군 5예(23.8%)에서 발생하였고, 이차암이 발생한 4예 모두 다염색체 소견 양성군이었으나 다염색체 소견에 따른 재발(p＝0.197)과 이차암 발생(p＝0.107)은 통계학적으로 유의한 관계가 없었다. 치료 실패한 예는 다염색체 양성군 15예(66.7%)에서, 음성군 4예(23.8%)에서 발생하여 다염색체 양성군에서 많았다(p＝0.012)(Table 6).
다염색체 소견과 치료 실패율
종양 조직에서 다염색체 소견에 따른 치료 실패까지 기간의 중앙값은 다염색체 양성군의 경우 12.0개월이었으며, 음성군은 중앙값에 도달하지 못하였다. 종양 조직에 있어 치료 실패율은 다염색체 양성군이 음성군에 비하여 유의하게 높았다(p＝0.0018)(Fig. 3).
절제연에서의 다염색체 소견에 따른 치료 실패까지의 기간은 다염색체 양성군에서 중앙값이 17.0개월이었으며, 음성군에서는 종양 조직에 따른 결과와 같이 중앙값에 도달하지 못하였다. 절제연에 있어 치료 실패율은 다염색체 양성군이 음성군에 비하여 유의하게 높았다(p＝0.0046)(Fig. 4).
다염색체 소견과 치료 실패 상대 위험률(relative risk ratio)
다염색체 소견, N 병기, AJCC 병기, 나이에 따라 치료 실패 상대 위험률을 비교한 결과 종양 조직(p＝0.0202)과 절제연(p＝0.0248) 모두 다염색체 소견만이 치료 실패를 예견하는 의미 있는 결과를 보였다(Table 7 and 8).
고찰
두경부 편평세포암종에서 원발 병소의 병기가 진행된 예에서 수술적 치료후 추적 과정에서 치료 실패가 많으나, 원발 병소의 병기가 진행되지 않은 조기암의 경우에서도 수술적 치료 후 국소재발 및 이차암의 발생 등 치료 실패를 경험하는 예를 흔히 볼 수 있다. 이렇게 원발병기가 진행되지 않았으며 충분한 절제연을 가지고 수술을 마친 예에서도 치료 실패를 일으키는 것으로 보아 원발 종양의 생물학적 특성이 치료 실패에 관여하는 것으로 생각되어 이러한 종양의 생물학적 특성을 찾고자 많은 연구가 이루어졌다. 그러나 현재까지 치료 실패의 가능성을 예견할 수 있으며 쉽게 접근이 가능한 표지자의 개발은 이루어지지 않았다.
두경부암의 발생과 진행(progression)에 대한 유전학적 변화의 과정에는 아직도 의문점이 남아있으나, 종양 세포가 정상 세포로부터 변형세포로 전환되는 일련의 과정에서 종양 세포의 특징인 조절이 되지 않는 성장과 증식 능력의 발생은 유전자 및 염색체 변화가 축적되어 일어나며, 종양의 유전학적 근거가 제시된 이후 종양과 유전자 변화와의 관계에 대하여 광범위하게 연구되었다.11) 그러나 어떠한 변화된 특정 유전자 및 염색체 조합이 암의 발생에 결정적 역할을 하는지는 현재까지 밝혀지지 않았다.
두경부암의 발생은 상부 기식도관 점막이 발암물질에 반복적으로 노출되어 유전자 또는 염색체의 변화가 발생하며 이러한 변화는 상부 기식도관 모든 부위 점막세포에 축적될 수 있고 여러 부위의 정상 점막세포에서도 종양이 발생할 가능성이 있어 두경부암에서는 이차암 또는 다발암이 호발 한다는 영역암 발생 개념이 도입되었다.2) Voravud등(1993)은 제7번과 17번 다염색체 소견이 종양 주위의 정상 점막이 과형성증, 이형성증, 종양으로 진행할수록 증가한다고 하였으며,12) Beckhardt(1995)등은 HER-2/neu 유전자가 종양과 절제연에서 발견된다는 보고를 하였고,13) Chung등(1993)은 일차암과 이차암에서 p53 변이가 서로 다른 것을 보고하였으며,14) Shin등(1994)은 전구암 조직에서 p53 변이가 증가하는 것을 보고하여15) 영역암 발생의 분자생물학적 근거를 제시하였다.
그러나 Sidransky등(1992)은 4명의 여자의 방광에서 발생한 13개의 다발암에서 X염색체 불활성화를 검사하여 이들 다발암이 하나의 변형된 세포에서 기원하여 타부위로 확산된 것이라고 주장하여3) 다발암에서 클론확산의 개념을 도입하였고 동일 종류의 X염색체만이 불활성화됨을 확인하였다. Bedi등(1996)은 8명의 여자 환자에서 발생한 13개의 두경부암에서 X염색체 불활성화를 검사하여 적어도 일부의 두경부암이 동일 클론에서 기원한다고 보고하여16) 두경부암에서도 클론확산의 개념이 도입되었다.
이러한 클론확산의 개념으로서 종양 주위 정상 점막 조직에도 염색체 변화가 발생하는 것을 이해할 수 있으며, 이러한 한 개의 변형세포 들이 조직병리학적으로 정상인 조직으로 확산되는 클론확산은 국소재발, 이차암 등 치료가 실패하는 원인이 될 수 있다. 실제 임상적 적용으로 Brennan등(1995)은 조직병리학적으로 절제연이 정상이었던 25예의 두경부 편평세포암종 환자의 절제연에서 p53의 변이를 검색을 하였다. 이 중 13예의 분자생물학적 검색에서 한 군데 이상에서 p53의 변이가 관찰되었으며, p53의 변이가 관찰된 13예 중 5예에서 추적 관찰 중 국소재발이 있었던 반면 p53의 변이가 없었던 12예에서는 재발된 예가 없었다. 따라서 이들은 절제연에서 원발 종양의 클론이 확산된 예를 분자생물학적으로 검색하여 보다 적극적인 보조치료를 실시하여야 한다고 주장하였다.6) 본 연구에서는 보다 쉽게 임상적 적용이 가능한 제17번 다염색체 소견이 클론확산 또는 영역암 발생의 개념을 배경으로한 치료 실패의 표지자로서의 가치가 있는지를 찾고자 하였다.
두경부암을 비롯한 충실성 종양(solid tumor)의 염색체 이상을 연구하는 방법 중 과거에서부터 시행된 핵형 분석의 문제점은 세포 배양을 실시하여 중기 핵에서 검색해야 하고 따라서 동일 종양에서도 배양된 세포에 따라 다양한 핵형(karyotype)이 존재하고, 세포 배양을 시행하는 동안 염색체의 이차 변화와 특정 염색체를 가진 세포만이 선택적으로 성장할 가능성이 있어, 이러한 핵형 분석이 충실성 종양을 대표하는 핵형이라고 판단하는데 무리가 있다.17)
최근 염색체에 높은 특이성이 있는 alpha-satellite(alphoid) DNA probe를 사용하면 표적이 되는 염색체 중심절 주변 지역에 probe가 하이브리드 결합을 하여 염색체 이상을 중기 핵뿐만 아니라 간기 핵에서도 확인이 가능하게 되었다. 이러한 probe를 이용하는 간기 세포 유전학(interphase cytogenetics)은 포르말린으로 고정한 후 파라핀으로 포매된 조직 절편에서도 응용이 가능하게 되었고8) 여러 장기의 충실성 종양에서 염색체의 수적 이상이 보고되었다.10)18)
유전자 돌연변이 종류는 염색체 수의 이상 또는 염색체 구조의 이상이 있는 것으로 알려져 있다. 염색체 구조 이상은 전위(translocation), 결손(deletion), 역위(inversion), 삽입(insertion), 증폭(amplification)의 다양한 형태로 발생하며, 염색체 수적 이상은 결손(loss), 중복(duplication)의 형태로 나타난다.19)
영장류 지놈(genome)에서 발견되는 alpha satellite D-NA(alphoid DNA)는 순차적으로 반복되는 DNA 군으로 단량체(monomer)는 171개 이하의 염기쌍으로 구성되어 있으며 순차적으로 반복하여 영장류의 염색체 중심절 부위에 존재한다. 인체내의 alpha satellite DNA는 전체 D-NA의 5%를 차지하며 제17번 염색체의 경우 2700 염기쌍으로 16개의 단량체 염기쌍이 반복된 구조로 되어 있으며 500∼1,000개의 반복된 형태로 존재하며, 제17번 염색체 DNA의 1.5∼3.0%를 차지한다.20) 이러한 DNA에 상보적인 probe로 ISH를 시행하면 나타나는 신호의 수는 제17번 염색체 중심절의 복제 수를 나타낸다.10)
두경부 편평세포암종에서 정상 세포, 과형성, 이형성, 상피내 암종, 침습성 암종의 순서로 제17번 다염색체 소견이 증가하는 보고가 있으며,12) 종양 조직과 절제연에서 모두 제17번 다염색체 소견이 보고되고 있어8) 본 연구에서는 제17번 염색체의 수적 변화를 확인하고 이러한 수적 변화가 두경부암의 예후를 예측 가능한가를 밝히고자 수술적 치료를 우선 시행하고 수술시 절제연이 병리조직학적으로 정상이었던 42예의 두경부 편평세포암종 환자에서 제17번 다염색체 소견을 종양 조직과 절제연에서 확인하였다. 종양 조직과 절제연에서 제17번 다염색체 소견을 백분율로 구하고, 치료 실패를 예견할 수 있는 절단점을 찾기 위해 여러 백분율로 검사 대상을 구분하여, 치료 실패와 유의하게(p<0.001) 관계 있는 최소 절단점을 찾고 이에 의거하여 제17번 다염색체의 소견의 양성군과 음성군을 구분하였다.
종양 조직과 절제연에서 제17번 다염색체 소견의 백분율에 따라 각각 절단점을 달리 설정한 이후 종양 조직과 절제연에서 환자의 임상적, 치료적 특성 차이가 다염색체 양성군과 음성군에 따른 차이로 변화되는 것을 방지하기 위해 예후에 영향을 미칠 것으로 추정되는 임상적, 치료적 특성을 비교한 결과 두 군간의 차이는 없었으나, 유일하게 종양 조직의 다염색체 양성군에서 N병기가 증가하여 차이가 있었다. 치료 실패의 위험성을 확인하는 상대 위험률은 예후가 나쁠 것으로 예상되는 종양 조직에 있어 N병기의 상대 위험률이 증가하지 않는 것으로 보아 두 군간의 N병기 차이는 무시하여도 될 것으로 생각되었다.
종양 조직의 경우 다염색체 양성군과 음성군은 재발, 치료 실패에 대하여 유의한 차이를 보였으며, 절제연의 경우 치료 실패만이 두 군간에 유의한 차이를 보였다. 이러한 결과를 토대로 수술 후 종양 조직과 절제연에 대한 다염색체 검사로써 추후 발생할 치료 실패에 대한 예측이 가능하리라 생각되었다. 이차암 발생은 종양 조직과 절제연의 다염색체 소견 유무와 유의한 관계가 있을 것으로 예상되었으나 이차암이 발생한 예가 전체 42예 중 4예로 대상 환자의 수가 작아 통계학적 유의성을 확인하지 못하였다. 두경부암에 있어 이차암 발생의 빈도는 치료 후 매년 약 3∼7%로 매년 보고되고 있으며,14) 본 연구에서는 최소 추적 기간이 3년이지만 보다 장기간 추적 관찰을 시행하고 대상 환자의 수가 많아지면 이차암 발생 여부를 예측 하는지를 보다 정확하게 판명할 수 있으리라 생각된다.
종양 조직의 경우 치료 실패를 촉진시키는 요인으로 의의가 있는 요소는 다염색체 소견이었다. 성별, 나이, T 분류, N 분류, AJCC 분류, 원발 부위, 종양의 병리조직학적 분화도, 치료방법 및 다염색체 소견을 단변량 분산분석에 의하여 유의한 의미가 있을 것으로 추정되는 4가지 요소를 찾고, 이를 대상으로 하여 다시 다변량 분산분석을 시행하였다. 다변량 분산분석에 의한 상대 위험률은 종양 조직의 경우 4.0590으로 비교하였던 다른 요소와 현격한 차이가 있었다. 절제연의 다염색체 소견 여부에 따른 상대 위험률도 유의한 관계가 있었으며, 상대 위험률은 3.3380로 다른 비교 요소보다 높았다. 치료가 실패할 때까지 기간의 중앙값은 종양 조직에 있어 다염색체 양성군의 경우 12개월이며 음성군은 중앙값에 추적 관찰 기간동안 중앙값에 도달하지 못하였으며, 절제연의 경우 다염색체 양성군은 17개월이었으며, 음성군은 중앙값에 도달하지 못하는 동일한 양상을 보였다. 따라서 종양 조직, 절제연에 있어 다염색체 양성군의 경우 시간이 경과함에 따라 치료 실패할 확률이 음성군에 비하여 높다는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서 절제연의 제17번 염색체 다염색체 소견이 많이 나타나면 재발 및 이차암 발생을 포함하는 치료 실패 가능성이 예견되므로 수술시 절제연에 종양이 없어도 절단점 이상으로 다염색체 소견이 발견될 때에는 치료 실패에 대비하여 방사선치료 등 보조치료 및 화학예방요법을 고려하여야 할 것으로 생각된다.
수술시 절제한 종양 조직 및 절제연을 병리조직학 검사 이외에 ISH 방법을 사용하여 조직의 제17번 다염색체 소견을 확인함으로서 환자의 예후를 예측하고 이에 대비할 수 있으리라 생각되어, 제17번 다염색체 소견이 치료 실패의 가능성을 예견하는 생체 표지자로서의 가치가 있는 것으로 생각된다.
결론
두경부 편평세포암종 환자의 경우 종양 조직 이외에 종양에 인접한 병리조직학적으로 정상인 절제연에서도 다염색체 소견을 보이며, 종양 조직과 절제연에 다염색체 소견이 많은 예에서 치료 실패가 많았다. 종양 조직 및 병리조직학적으로 정상 절제연에서의 제17번 다염색체 소견이 예후를 예견하는 의미 있는 표지자로서의 가치가 있는 것으로 생각되며, 종양 조직 및 절제연에서 제17번 염색체가 다염색체의 소견을 보이는 경우 예후가 불량한 경우가 많으므로 적극적인 보조치료를 고려해야 할 것으로 생각된다.
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