Address for correspondence : Dong-Hee Lee, MD, Department of Otolaryngology-HNS, The Catholic University of Korea College of Medicine, 65-1 Geumo-dong, Uijeongbu 480-717, Korea
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서     론

   의사소통은 인간을 사람답게 만들어주는 중요한 역할을 하며, 이러한 측면에서 난청은 사람을 인간사회에서 고립시킬 수 있기 때문에 가용청력 혹은 사회적응 청력(serviceable hearing)을 유지하는 것이 중요하다. 하지만 난청은 가장 흔한 장애의 한 가지로서 많은 사람들이 난청을 앓는데 이중의 상당수가 치료받지 못하고 난청을 지닌 채로 살아간다. 정확한 통계는 없으나 한 보고에 따르면 보청기로 도움을 받을 수 있는 난청 환자의 20%만이 보청기를 착용하고 있고 나머지는 난청을 지닌 채로 불편하게 사회생활을 하고 있다고 한다.¹⁾ 보청기는 난청을 치료하는 도구라기보다는 청각재활의 방법으로써 외부 소리를 증폭하여 외이, 중이를 통하여 내이에 전달해주는 역할을 한다고 볼 수 있는데, 고도 난청을 가진 환자와 같이 상당수 난청 환자가 보청기로는 충분한 효과를 보지 못하고 있다. 현재까지 고도 난청 환자는 인공와우이식을 통하여 청각재활을 받고 있으나 이 또한 많은 제한점과 어려움을 내포하고 있어 많은 연구자들이 보다 궁극적이고 나은 치료방법의 개발에 몰두하고 있다.
   감각신경성 난청은 내이의 와우에서 감각세포와 청신경의 손상으로 인한 난청으로 전체 난청의 상당수를 차지하고 현재까지는 일부 제한된 경우를 제외하면 치료가 안 된다. 와우를 구성하는 세포들 중 감각세포는 출생 시 15,000개 조금 못 되는데 내유모세포와 외유모세포로 대변되는 이 감각세포가 바로 청각계의 취약점이다. 일반적으로 외유모세포는 내유모세포보다 노화 및 각종 유해인자에 더 취약하고 일단 감각세포가 소실되면 코르티씨 기관의 지지세포들은 점진적으로 탈분화에 빠진다.^2,3,4) 
   따라서 손상 받은 감각세포 및 지지세포, 청신경의 재생이야말로 감각신경성 난청의 궁극적인 치료방법이라고 할 수 있으나, 한 가지 감각세포만을 재생하는 것도 현재로서는 요원한 일이고 설사 그것이 가능하더라도 그것만으로는 와우 및 청신경계에서 일어나는 복잡한 청각생리를 회복시킬 수 없기 때문에 단순히 감각세포를 재생하는 것이 와우 줄기세포 연구의 종착점은 아니다. 서로 다른 기능을 지닌 외유모세포 및 내유모세포와 같은 감각세포의 재생도 중요하지만 이들 감각세포와 주변의 여러 종류의 지지세포들과의 유기적인 결합, 나아가서는 청신경과의 연접까지도 고려해야 한다. 결론적으로 와우 줄기세포 연구는 단순히 감각세포의 재생만을 의미하는 것은 아니고 청각 재생의학의 시작점에 불과하다고 할 수 있다.
   저자는 본 종설의 첫 번째 부분에서 포유류 와우에서 감각세포 및 지지세포의 발생에 대해서 고찰하고, 두 번째로는 와우 줄기세포의 발견 및 현황을, 마지막으로는 와우 줄기세포에 대한 최근 연구에 대하여 기술하였다.

Molecular Basis of Development of the Mammalian Cochlea(Rat)

   쥐에서 내이 형성은 배아일(embryonic day; E) 8일째 hindbrain rhombomeres 5~6에 인접한 두부 외배엽의 placodal thickening으로 시작된다. E8.5~9.0일부터 기원판(placode)이 함입되면서 otic cup을 형성하고 여기로부터 8번 뇌신경절의 신경모세포(neuroblast)가 전복측(anteroventrally)으로 엽렬하여 내측으로 이동한다. E9.5일까지 otic cup은 폐쇄되고 표면의 외배엽으로부터 분리되어 구형의 이소포(otic vesicle, otocyst)를 형성한다. 이후 6일동안 이소포는 성숙되고 보다 복잡한 구조로 발달되는데 감각세포와 비감각세포들로 분화한다. 이소포의 형태형성은 E10.5일에 등내측(dorsomedially)으로 내림프낭이 자라고 복측으로는 와우관이 자라면서 시작된다. E11.5일에 이상피(otic epithelium)가 등외측(dorsolaterally)으로 팽출(evaginate)하면서 전반규관과 후반규관의 전신인 수직관판(vertical canal plate)을 형성하고, 바로 직후에 외측으로 팽출하면서 측반규관의 전신인 외측관판(lateral canal plate)을 형성한다. 반규관은 E12.5일에 수직관판의 두 중심부와 외측관판의 중심부가 융합되고 E13.5일에 융합된 세포가 상피로 흡수된다. 이 시기 동안 중심부의 다른 팽출부는 등측의 난형낭(utricle)과 배측의 구형낭(saccule)을 형성한다. E15.5일까지 내이 상피는 완전한 형태를 형성한다.^5,6,7,8)
   줄기세포 및 재상의학 측면에서 바라본 내이의 발생은 다음과 같이 3단계로 나누어 생각할 수 있다. 1) 외배엽이 신경감각 전구세포(neurosensory precursor cell)를 포함한 이성 외배엽으로의 변환, 2) 이성 외배엽으로부터 신경감각 전구세포의 발생, 3) 감각상피의 정해진 부분에 감각 전구세포(sensor precursor cell)로부터의 유모세포와 지지세포의 생성.

Turning embryonic ectoderm cells into otic neurosensory cells: the molecular basis for otic neurosensory induction(Fig. 1)
   이 단계에서는 중배엽과 신경외배엽으로부터의 신호전달물질이 필요한데 기본적으로는 신경판(neural plate)이나 후각계의 유도과정과 동일하다. 즉, 이 2가지의 유도과정과 마찬가지로 fibroblast growth factor receptor(FGFR) signaling에 기초하는데 bone morphogenetic protein(BMP) signaling의 억제와 동반한다. 이 유도과정은 4가지 종류의 신호전달물질을 필요로 하는데, 포유류에서는 척삭(notochord)으로부터의 sonic hedgehog homolog(SHH)과 중배엽 및 신경외배엽으로부터의 FGF3, FGF8, FGF10, 능형뇌(hindbrain)로부터의 Wnt와 외배엽으로부터의 BMP4가 그것이다. 이 신호전달물질의 작용으로 인하여 외배엽성 세포들이 이판(otic placode)을 형성하도록 변화된다. 이판에서 proneuronal gene neurogenin 1(Neurog1)의 상향조절로 neurosensory phenotype가 만들어지는데, 이판의 유도과정에서 가장 중요한 마지막 단계인 Neurog1은 쥐에서 E8.75일에 나타나기 시작한다. Neurog1 이외에도 Gata3, Pax2/8, Tbx1, Foxg1, Foxi1, Eya1/Six1, Oct4 등이 이판의 유도과정에 관여하며 이들간의 상호작용은 BMP signaling에 의하여 이루어진다. BMP signaling은 beta catenin-mediated Wnt signaling과도 상호작용하는데, 특히 Wnt signaling은 이판의 생성뿐만 아니라 이후 내이 발생에도 관여하는 것으로 알려져 있고 SHH도 Neurog1을 통하여 간접적으로 BMP signaling에 상호작용하는 것으로 알려져 있다.^9,10,11)

The molecular basis of inner ear neurosensory cell generation 
   유모세포와 지지세포를 형성할 prosensory cell이 처음으로 나타나는 것은 E10.5일이고, 이 시기 이후에 여러 가지 유전자가 감각상피가 될 부분에서 발현되는데 BDNF, Ntf3, Bmp4, Lnfg, Sox2, Islet1, FGF10 등이 그것이다. 더불어 E10.5일에는 신경감각 전구세포는 3가지 종류의 세포군으로 나뉘는데, 유모세포와 지지세포로 분화하는 prosensory cell, 신경세포로 분화하는 proneural cell, 그 외 내이 세포로 분화하는 nonsensory cell이다. Proneural cell은 Neurog1을 표현하고 prosensory cell은 Sox2를 표현하는데, Neurog1 null mice에서 유모세포와 지지세포가 40~80% 감소하며 비교적 나중에 표현되는 bHLH(basic-Helix-Loop-Helix) 유전자인 Neurod1은 유모세포의 발생보다는 신경의 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 Sox2와 Atoh1 null mice에서 유모세포가 발생되지 않는 것으로 보아서 이 유전자들이 유모세포 발생에 중요함을 알 수 있고, 지지세포의 발생은 유모세포와의 상호작용하에 Notch, Hes에 연관됨이 알려져 있다.^9,10,11)

Specification of hair and supporting cells(Fig. 2)
   현재까지의 연구로는 유모세포가 지지세포보다는 먼저 감각상피에 출현하고 이후 Notch signaling을 통한 lateral inhibition을 통하여 유모세포와 지지세포의 분화가 결정된다고 알려져 있다. Notch1은 와우관에 고루 분포하지만 Jagged2(Jag2), Delta-like 1(Dll1), Delta-like 3(Dll3)은 유모세포로 분화하는 세포에서만 발현되고 지지세포로 분화되는 세포에서는 Hes1, Hes5, Hey1, Hey2, Heyl(Hesr3)와 같은 Notch 표적유전자가 발현된다.^10,12,13,14)
   Notch signaling에 대한 연구를 통하여 감각상피 내 분화에 관여하는 다른 인자들이 많이 발견되었는데 bHLH 전사인자군이 이에 해당되고 이들은 Notch signaling에 의하여 억제된다. bHLH 전사인자군 중 가장 대표적인 것이 바로 Atoh1인데 Atoh1과 Notch에 대해서는 이후에 다시 언급하겠다. 여기서는 Atoh1이 발현되는 전구세포가 유모세포로 먼저 분화되고 발현된 Atoh1은 Notch signaling의 lateral inhibition을 통하여 인접한 전구세포의 Atoh1의 발현을 억제하여 지지세포로 분화시킨다는 가설이 가장 유력하다는 것만을 기억하자.
   Id(inhibitors of differentiation) 역시 bHLH를 길항하는데 Id1, Id2, Id3은 유모세포 발생 이전까지 전구세포에서 발현되다가 유모세포가 출현하면서 감소한다.
   Prosensory cell은 Atoh1과 같이 유모세포로 분화시키는 인자와 Sox2, Prox1과 같이 Atoh1을 길항하여 유모세포로 분화하는 것을 막는 인자 간의 상호작용에 의하여 유모세포 혹은 지지세포로 분화한다. Sox2는 유모세포로 분화시키려는 Atoh1의 영향을 직접적으로 길항하고 Sox2의 표적유전자인 Prox1의 과표현 역시 Atoh1의 활동을 억제하며, 반대로 Atoh1은 Sox2를 하향조절한다. Sox2가 초기에는 prosensory cell의 발생에 필요하지만, 이후에도 지속적으로 Sox2가 발현되면 유모세포의 발생을 억제하므로 내이 발생과정에서 어느 단계에서는 Sox2의 하향조절이 필수적이다.^10,12,13,14)
   이상에서의 유모세포 분화와 달리 지지세포의 분화에 대해서는 아직 모르는 것이 많다. 하지만 지금까지의 연구결과를 종합하면 먼저 분화된 유모세포가 주변 전구세포를 지지세포로 분화하도록 유도하는 것으로 보이며, 이 과정에서 Notch signaling의 lateral inhibition이 관여하는 것으로 보인다.^10,12,13,14)
   또한 fibroblast growth factor(FGF)도 초기 단계에서 중요할뿐더러 나중에 유모세포 및 지지세포의 형성에 필수적인데, E16.5일에 나타나기 시작한 FGFR3가 상향조절되는 전구세포는 외유모세포, 기둥세포(pillar cell), Deiters 세포로 분화된다. 하지만 이후 분화가 진행될수록 FGFR3는 기둥세포로 분화하는 전구세포에 국한되고 동시에 FGFR3 domain의 내측에 내유모세포가 될 전구세포에서 FGF8이 발현된다.^10,12,13,14)

Discovery of Cochear Stem Cell or Progenitor Cell in Cochleae of Different Vertebrates

Discovery of regeneration from damaged cochlea; lessons from birds, frogs and fish
   인체에는 일생 동안 재생을 하는 세포가 있고 손상 이후에 재생을 하는 세포가 있지만, 약간의 증식능력과 극소수의 재생능력을 갖고 있는 전정계의 일부 세포를 제외하면 전반적으로 내이의 세포들은 이 재생능력이 모두 결여되어있다.^{13,15,16,17,18,19)}
   1980년대 초반에 들어서면서 포유류가 아닌 척추동물의 와우에 출생 이후에도 유모세포를 재생할 수 있는 능력이 있으며 손상으로 유모세포가 죽으면 이를 재생할 수 있는 능력을 가진 줄기세포가 있음이 발견되었다. 대표적으로 어류와 양서류는 그들의 평형기관인 엽선과 전정기관에서 새로운 유모세포를 형성한다는 것이 발견되었다.^20,21) 또한 이러한 전정세포의 재생은 조류에서도 관찰되었는데,^22,23,24,25) 전정 유모세포뿐만 아니라 청각 유모세포도 재생되어 손상된 감각기관의 기능을 회복시킬 수 있음을 확인하였다.^24,26,27) Corwin과 Cotanche는 지지세포나 줄기세포가 유사분열을 하여 유모세포를 재생함을 각자 따로 보고하였고,²³⁾ Ryals과 Rubel은 이러한 재생능력을 가진 줄기세포가 다 자란 개체에서도 존재하고 있으나 일생 동안 불활성화된 상태로 내이에 존재한다고 보고하였다.²⁸⁾
   Stone과 Cotanche가 조류의 유모세포 재생 기전을 다음과 같이 2가지로 나누어 설명했는데, 손상 이후 초기에는 지지세포가 세포분열 없이 유모세포로 직접 transdifferentiate한다(direct transdifferentiation). 이후 3~4일이 지나면 일부 지지세포는 세포주기로 다시 들어가 세포분열을 통하여 유모세포와 지지세포를 생성한다(asymmetric division)(Fig. 3).²⁹⁾ 하지만 모든 조류 지지세포가 유모세포로 분화 혹은 세포분열할 수 있는지, 아니면 지지세포 중 일부만 그럴 수 있는지는 아직 모른다. 일부 보고에 따르면 이독성 이후에 지지세포의 1/4은 세포분열을, 1/4은 transdifferentiation을 1/2은 그대로 지지세포로 남아있다고 하며, 지지세포로 그대로 남는 1/2은 이후 손상에 따른 재생을 위한 줄기세포군을 보존함으로써 전체 재생능력 유지에 중요한 역할을 한다고 추정된다.³⁰⁾

Discovery of regeneration from damaged cochlea in mammals
   '포유류가 아닌 척추동물에는 있는 유모세포 재생능력이 왜 포유류에서는 없을까?'라는 질문에 과학자들은 진화과정에서 그 해답을 찾고 있다. 포유류의 진화과정에서 와우의 코르티씨 기관은 고주파영역의 소리를 보다 잘 듣기 위하여 유모세포의 수를 줄이고 기저막의 민감도를 증가시킬 수 있도록 지지세포를 특수하게 진화시켰다는 것이 설명이다.^31,32) 이러한 진화과정을 통하여 내유모세포 및 외유모세포는 stereotyped arrangement를 하였고 지지세포는 특수하게 분화되었는데, 이 과정에서 지지세포는 재생능력을 잃었다는 것이다. 즉, 우리 포유류의 조상은 고주파음의 청력을 위하여 손상을 재생할 수 있는 능력을 희생한 것이다.
   아무튼 비포유류에서의 유모세포 재생의 발견은 포유류에서도 이러한 능력이 있음을 발견할 수 있는 계기가 되었다. 1993년 포유류 성체의 전정상피에서 아미노글리코사이드 이독성 이후에 유모세포가 재생됨이 보고되었다.^33,34) 포유류 전정기관에서 유모세포는 죽은 세포에 연접한 지지세포가 세포주기로 다시 들어가 세포분열을 통하여 asymmetric division을 하여 새로운 유모세포와 지지세포를 만들어낸다. 어떤 경우에는 transdifferentiation의 형태로 새로운 유모세포가 만들어지기도 한다.¹⁴⁾ 최근의 연구결과에 따르면 포유류 신생아의 와우 줄기세포는 자체의 증식능력뿐만 아니라 Myosin VIIa, Parvalbumin 3 등과 같은 유모세포 표식자를 표현하는 세포-유모세포 유사세포-를 체외에서 생성할 수 있는 능력이 있다. 새롭게 생성된 유모세포는 쥐의 코르티씨 기관의 greater epithelial ridge(GER) 혹은 lesser epithelial ridge(LER)에 있는 줄기세포에서 생성된다고 알려져 있다.^14,35) 기존의 연구에 따르면 배아 혹은 신생아기에 존재하는 줄기세포의 재생능력은 쥐의 경우 출생 2~3주 사이에 소실된다.³⁶⁾ 줄기세포는 포유류 성체의 와우에서도 존재하는데 다만 성체에서는 손상 이후 유모세포의 재생은 체내에서 저절로 시작되지 못한다.
   Malgrange 등은 신생아 쥐의 코르티씨 기관에서 물리적으로 해리된 세포를 epidermal growth factor(EGF), FGF2 하에서 현탁배양(suspension culture)하여 이들 중 일부를 증식시켜서 floating colonies를 생성했는데, 이 colony중 세포분열을 하는 세포의 일부가 유모세포나 지지세포로 분화하는 능력을 갖고 있고 이것이 바로 와우 줄기세포라고 보고하였다.³⁷⁾ 이후에도 많은 연구자들이 포유류의 와우 줄기세포를 이용하여 유모세포를 재생하는 연구를 보고하였는데,^38,39,40) Oshima와 Stefan가 가장 최근 연구보고에서 발표한 쥐 배아 줄기세포(ESC)와 유도만능 줄기세포(iPSC)를 사용하여 "hair cell-like cells with mechanosensitive stereociliary bundles"를 만드는 단계적 지침³⁶⁾을 본 종설의 마지막 단계에서 다시 자세히 다루겠다.

Control of sensory cell differentiation in the inner ear; Atoh1 and Notch(Fig. 4)
   발생단계의 와우에서 유모세포로 분화를 유도하는 첫 번째 인자가 바로 bHLH 전사인자인 Atoh1(혹은 Math1)의 출현으로 쥐에서는 E14일에 나타난다.⁴¹⁾ Atoh1은 청각 및 전정 감각상피로 분화될 prosensory patch에서 발현되는데 유모세포가 성숙할수록 하향조절되는 것으로 보아 주작용이 유모세포로의 분화 유도에 있는 것으로 생각되며 지지세포의 transdifferentiation을 유도하여 유모세포를 재생하는 것으로 추정된다.^41,42) 그래서 손상 이후 유모세포의 재생 초기 단계에 Atoh1을 이용하여 유모세포를 재생할 수 있다는 연구가 많이 이루어져 왔고 몇몇 연구는 그 성과를 보고하기도 했다.^{15,38,39,43,44,45,46,47)}
   발달단계에서 유모세포로의 분화를 결정하는 두 번째 인자는 바로 Notch signaling이다.^48,49) 발달단계에서 Notch 수용체의 활성은 Hes와 Hey 유전자를 상향조절함으로써 유모세포의 분화를 억제하는데, Hes와 Hey는 모두 Atoh1의 강력한 억제인자이다. Notch ligand를 많이 생성하는 세포가 바로 이웃한 세포로 하여금 Notch ligand를 적게 만들게 하고, 이웃한 세포의 Notch ligand 감소는 다시 Notch ligand 과다 세포로 하여금 Notch ligand를 더 많이 만들게 하는데(lateral inhibition feedback loop), 이러한 lateral inhibition은 자신과 이웃한 세포를 자신과는 다른 발달단계를 밟게 만들며, 이로 인하여 유모세포와 지지세포의 stereotyped mosaic pattern을 형성한다고 알려져 있다.^{19,50,51,52,53)} 이후 많은 실험을 통하여 배아 지지세포는 Notch1과 Notch3 수용체를 발현하고 분화하는 유모세포는 Notch ligand인 Delta1과 Jagged2를 발현하는데,^{54,55,56,57,58)} 지지세포는 downstream Notch effector인 Hes와 Hey를 발현하며,^54,57) Hes와 Hey는 배아 와우조직에서 Atoh1의 전사를 억제하여 유모세포로 분화를 유도하는 Atoh1의 기능을 억제하고,^50,59,60) 조류에서 유모세포가 재생되는 단계의 초기에 Delta1과 같은 Notch ligands가 상향조절되며,⁶¹⁾ 쥐에서 Delta1과 Jagged2와 같은 Notch ligands를 삭제하거나 Notch signaling을 불활성화시키는 약물처리 이후에 과도하게 많은 수의 유모세포가 생성됨이 알려졌다.^{17,18,54,55,62)}

Recent Advances in Cochlear Stem Cell Research; Stefan Heller's Work³⁶⁾

   Stanford 대학 이비인후과학교실에서 와우 줄기세포 연구를 하고 있는 Stefan Heller 등은 최근 연구논문에서 초기 배아 발생의 원칙을 적용하여 줄기세포를 이용하여 귀 전구세포(otic progenitor cell)를 만들고 나아가서 mechanosensitive sensory hair cell을 만드는 방법을 제시하였다. 그들은 쥐에서 분리한 ESC와 iPSC를 이용하여 만능줄기세포가 이 전구세포 계열로 분화를 시킬 수 있음을 보여주었고 이를 분화시켜 생리학적으로 mechanosensitive한 stereociliary hair bundle을 가진 유모세포 유사세포를 만들 수 있음을 보여주었다. 이제 본 종설의 마지막으로 그들의 연구결과를 간단하게 정리해 보았다(Fig. 5). 

1단계. ESCs and iPSCs from Math1/nGFP Mice
   그들은 transgenic mouse strain Math1/nGFP을 사용했는데 Atoh1이 발현되면 nuclear variant of enhanced green fluorescent protein(nGFP)을 표현하여 유모세포가 녹색 형광을 띄도록 만든 쥐였다. 이 유전자 조작 쥐를 이용하면 면역형광염색 없이도 유모세포 혹은 유모세포로 분화하는 세포를 형광형미경하에서 확인할 수 있다.
   1) ESC 채취; Math1/nGFP 배반포로부터 leukemia inhibitory factor(LIF)하 mouse embryonic fibroblast feeder에서 배양하면서 Oct4, Nanog, Sox2, Gbx2와 같은 ESC 표식자를 표현하고 ESC colony 형태를 보이는 ESC를 채취했다.
   2) iPSC 제작; Math1/nGFP 배아 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4, cMyc 역전사바이러스에 감염시켰다.⁶³⁾ 일차 colony를 채취하여 mouse embryonic fibroblast feeder에서 배양했다.
   *ESC와 iPSC가 GATA6, Brachyury, microtubule-associated protein 2(MAP2)를 표현함을 확인했는데, 각각 내배엽, 중배엽, 외배엽성임을 증명하는 표식자들이다.
   **ESC와 iPSC를 면역결핍 쥐에 이식하여 3배엽으로 구성된 기형종을 생성함을 확인하여 ESC와 iPSC가 pluripotency를 지님을 입증하였다.

2단계. Generation of Presumptive Ectoderm that Is Competent to Otic Induction
   1) 먼저 ESC와 iPSC를 외배엽성으로 만들고자 했는데, 발생 초기단계에서 원시선(primitive streak)이 발생하면서 내배엽, 중배엽, 외배엽의 3배엽 체제가 만들어진다는 사실에 착안하였다. 즉, 그들은 원시선의 발생을 억제하면 내배엽과 중배엽의 형성을 막을 수 있을 것이라고 가정했는데 원시선의 발생은 Wnt와 bTGF에 의하여 진행되므로 Wnt와 bTGF를 억제하면 외배엽성 줄기세포로의 발달을 증가시킬 수 있을 것으로 가정했다. 
   그들은 Wnt 억제제인 Dkk1와 bTGF의 억제제인 selective inhibitor of Smad3(SIS3), IGF-1을 사용하였다. 그들은 이 3가지를 모두 처리했을 때 중배엽성 줄기세포의 비율을 ESC 경우 20.8±13.1%, iPSC 경우 14.3±5.8%, 내배엽성 줄기세포의 비율을 ESC 경우 9.8±5.0%, iPSC 경우 12.1±6.8%로 감소시킬 수 있었다.
   2) bFGF는 여러 FGFR을 활성화하여 otic induction을 유도하는 것으로 알려져 있어서 Dkk1, SIS3, IGF-1 처리 후에 bFGF를 처리하였다.^{6,64,65,66,67)} otic induction을 확인하는 표식자로는 면역형광염색은 Pax2, Pax8, Dlx5를 RT-PCR은 Pax2, Pax8, Dlx5, Six1, Eya1를 사용하였다. 그들은 이 방법으로 Pax2 양성 세포 비율을 ESC 경우 29.8±7.1%, iPSC 경우 19.6±5.6%로 증가시킬 수 있었다.

3단계. Hair Cell Differentiation
   Li 등⁶⁸⁾은 성장인자 없이 serum-free culture on gelatin를 하는 것이 귀 전구세포를 분화시키는 가장 좋은 방법임을 보고한 바 있다. 이에 그들도 ESC 및 iPSC 유래 귀 전구세포를 성장인자 없이 serum-free culture onto a layer of mitotically inactivated chicken utricle stromal cells을 하였다. 
   유모세포의 확인은 myosin VIIa와 espin으로 하였는데, 그들은 10,000개의 세포당 ESC 경우 139±49개, iPSC 경우 113±24개의 myosin VIIa 양성세포를, ESC 경우 36±7개, iPSC 경우 24±19개의 espin 양성세포를 얻을 수 있었다. 또한 흥미롭게도 유모세포 유사세포 주변에 지지세포 표식자인 p27Kip1 양성세포가 같이 발견되었다.
   *새로 생성된 유모세포 유사세포가 chicken utricle stromal cell에서 유래된 것이 아님을 증명하기 위하여 Math1/nGFP 쥐를 사용하여 nGFP 양성인 세포만을 관찰하였고, 사전에 inactivated chicken utricle stromal cell만을 3주간 배양하여 유모세포가 생성되지 않음을 확인하였으며, ESC와 iPSC에서 유래한 myosin VIIa와 nGFP 공통 양성 세포가 닭에 특이적인 Ptprq의 항체에 면역염색되지 않음을 확인하였다.

4단계. ESC- and iPSC-Derived Hair Cell-like Cells Have Stereociliary Hair Bundles
   전자현미경을 이용하여 stereociliary hair bundle을 확인하였고, stereocilia 표식자인 F-actin, beta-tubuin, espin 및 tip link 표식자인 cadherin 23으로 면역형광염색을 하였다.

5단계. ESC- and iPSC-Derived Hair Cell-like Cells Are Mechanosensitive: Hair Bundle-Bearing ESC- and iPSC-Derived Cells Display a Variety of Voltage-Dependent Currents
   마지막으로 이상의 방법으로 만들어진 유모세포 유사세포가 mechanosensitive하며 voltage-dependent current를 생성함을 확인하였다.

결     론

   최근 들어 많이 이루어지고 있는 줄기세포 연구 및 재생의학은 이과 분야에서도 '청각 재생'이라는 측면에서 진일보하고 있으며 난청을 가진 환자와 보호자들에게 많은 희망을 주고 있다. 하지만 아직 풀어야 할 숙제가 많고 임상 적용까지는 넘어야 할 많은 산이 있기에 우리 의사들은 아직은 신중하게 접근해야 할 것이다. 의사와 환자 모두는 줄기세포 연구 및 재생의학의 현실을 파악함으로써 과학적 진보와 치료방법으로서의 임상 적용 사이에 혼동이 오지 않도록 해야 한다. 특히 지금과 같은 선정적 대중매체와 인터넷 등을 통한 정보의 홍수 속에서 환자 및 보호자들이 비윤리적인 상혼에 휘말리지 않도록 의사들은 정확한 지식을 알고 상담에 임해야 할 것이다. 또한 그에 못지않게 인류 건강을 위한 연구를 하는 과학도로서 줄기세포 연구 및 재생의학 분야에서 보다 많은 노력이 필요할 것으로 생각한다.

1. Groves AK. The challenge of hair cell regeneration. Exp Biol Med (Maywood) 2010;235(4):434-46.

2. Merchant SN, Adams JC, Nadol JB Jr. Pathology and pathophysiology of idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Otol Neurotol 2005;26(2):151-60.

3. Nadol JB Jr, Merchant SN. Histopathology and molecular genetics of hearing loss in the human. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2001;61(1):1-15.

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