교신저자：이재훈, 570-711 전북 익산시 신용동 344-2  원광대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(063) 859-1441 · 전송：(063) 841-6556 · E-mail：nose-1023@hanmail.net

서     론

   비용은 최근 수술기구 및 기술의 발달로 수술성적이 좋아지고 있으나 아직까지 여전히 재발률이 높은 질환이다. 비용의 정확한 병태생리가 알려져 있지 않은 것이 치료가 잘 안 되는 이유라 할 수 있다.
   Proteomics는 이차원적 전기영동(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)과 질량분석기(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)를 이용하여 조직이나 체액 내에 존재하는 모든 단백질을 분리하고 분석하는 방법으로서, 단백질의 성질을 발현양상 및 유전자전이후변형(post-translational modification), 단백질과 단백질간의 상호작용(protein-protein interaction)에 초점을 맞추어 연구하여 세포 내 변형과정 및 질병의 병태생리와 연계시켜 총괄적으로 이해할 수 있는 분야를 말한다.^1,2)
   본 연구는 proteomics를 이용하여 비용의 단백질 조성을 정상 하비갑개점막과 비교분석함으로써 비용의 병태생리에 관여하는 단백질들을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

조직채취
   만성 부비동염 및 비용으로 진단 받은 후 부비동 내시경수술을 받은 5명으로부터 채취된 비용과 융비술을 받은 5명의 환자로부터 채취된 하비갑개조직을 대상으로 하였다. 두 군에서 모두 알레르기를 동반한 환자는 제외하였으며 수술 1달 전부터 항생제, 항히스타민제 및 전신적 또는 국소적 스테로이드를 사용한 경우는 제외하였다. 채취된 조직은 곧바로 액화질소에 동결처리하였으며 사용시까지 -70도에 보관하였다. 본 연구는 병원 내 임상실험윤리위원회의 승인을 얻어 실시하였다.

방  법

단백질 분리
   본 연구는 Lee 등²⁾이 사용한 실험방법을 참고하여 시행하였다. 간단하게 서술하면 비용조직과 정상 하비갑개조직을 조직용해완충액(sample lysis buffer) 1 mL당 50 mg의 조직농도로 조직분쇄기(tissue homogenizer) 및 초음파분쇄기(sonicator)를 사용하여 조직을 용해하였다. 분쇄된 조직은 약 100,000 g에서 1시간 동안 원심분리를 시행하여 상층액을 분리하였다. DNA와 RNA 그리고 기타 부유물을 제거하기 위해 DNase/RNase로 처리하였으며, 단백질 수용액에 포함된 지질을 제거하기 위해서 acetone으로 처리한 후 다시 원심분리하였다. 침전물을 취한 다음 단백질 용해액을 넣어서 녹인 후, 전기흡광도측정기(SIROS, SEAC, Radium Co, Italy)를 사용하여 상층액의 단백질 농도를 정량하였으며 이차원적 전기영동시까지 -70도에 보관하였다.

전기영동
   추출된 단백질에 대해 전기영동을 시행하였는데 일차적 전기영동은 Protean isoelectric focusing(IEF) cell(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 18 cm의 pH 3-10, 4-7 IPG (immobilized pH gradient) strip(Bio-Rad)을 사용하여 시행하였다. 이차적 전기영동은 Protean XL system(Bio-Rad)을 사용하여 9~17% SDS-PAGE gel에서 시행하였다. 이차원적 전기영동이 완료된 gel은 Coomassie blue로 염색한 후 발현되는 단백질 반점을 관찰하였다.

이미지 분석
   염색된 gel은 스캔 후 2% acetic acid 용액에 보관한 후 영상은 ImageMasterTM 2D Platinum Software(version 5.0, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA)로 이미지 분석을 하였으며, 이를 통해 정상 하비갑개점막 및 비용에서의 단백질 발현양상을 비교분석하였다. 정상 하비갑개조직과 비교하여 비용에서 과발현(up-regulation) 혹은 저발현(down-regulation)되는 단백질 반점들을 선택하여 분석에 사용하였다.

단백질 동정 및 Bioinformatics
   Trypsin으로 처리된 단백질이 여러 개의 펩타이드 조각으로 분해되면 이를 matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(Applied Biosystems, Forster city, USA)를 사용하여 질량분석 후 등전점(isoelectric point)과 분자량(molecular weight)에 적합한 단백질을 테이터베이스 탐색은 Matrix Science(http: //www.matrixscience.com)에서 monoisotopic peak값을 이용해서 SWISS-PROT(http://kr.expasy.org/)와 Nation Center for Biotechnology Information(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 단백질 테이터베이스를 검색하였다. 본 연구는 각각의 2회의 실험을 통해 재현성을 확인하였다.

결     과

   정상 하비갑개조직과 비용조직을 이차원적 전기영동을 이용하여 단백질을 분리하고 젤을 Coomassie blue로 염색한 후 양측 모두에서 500여 개의 단백질 반점들이 관찰되었으며 Fig. 1은 각각 정상 하비갑개조직과 비용조직의 이차원적 전기영동 단백질 발현양상을 보여주는 사진이며, 양측 사진은 전체적으로 비슷한 발현양상을 보여주고 있다.
   ImageMaster^TM 2D Platinum Software를 이용하여 이미지 분석을 시행한 결과 정상 하비갑개조직을 기준으로 하여 비용조직에서 과발현된 혹은 저발현된 단백질 반점 각각 6개씩 총 12개를 확인하였다(Fig. 2).
   과발현된 혹은 저발현된 단백질 반점들을 MALDI-TOF MS를 사용하여 분석한 결과 Table 1과 같은 단백질을 확인할 수 있었다. 저발현된 단백질은 two vimentins(number 1, 4 in the Table 1), two actin C(number 2, 7 in the Table 1), fibrinogen beta, hemoglobin subunit beta이고, 과발현된 단백질은 annexin A2, keratin 16, actin B(number 8 in the Table 1), serpin 3, glutathion S-transferase P, coactosin like protein이었다(Table 1).

고     찰

   비강 및 부비동에 생기는 비용은 흔한 질환으로 종양이라기보다는 부종이 동반된 일종의 국소적 염증반응으로 표면이 매끄러운 유동성 종괴 형태로 나타난다. 비용의 정확한 병태생리는 알려져 있지 않으나 염증반응과 세포증식이 중요한 기전으로 알려져 있다.³⁾ 염증반응 동안에 혈관증식 및 확장, 활동적인 세포외기질(extracellular matrix) 개조 그리고 면역기전의 활성화와 같은 복합적인 기전들이 관여하고 있다. 세포증식에는 transforming growth factor-B, basic fibroblast growth factor 등이 작용하고 있다. 그러나 아직까지 비용의 발생과 증식에 대한 정확한 기전은 알려져 있지 않았다.⁴⁾
   Proteomics의 이용은 세포 내 단백질의 생리 상태별(예, 암과 정상조직) 발현차이와 세포 내 상태별 특정 단백질의 정량적 차이 및 변형상태를 규명하는데 긴요하며,⁵⁾ 또한 각종 질환 표지자와 치료표적 단백질의 발굴과 동·식물성장조절단백질의 규명, 생식기전 및 약물독성과 신의약 개발을 들 수 있다.⁶⁾ 그러나 proteomics의 단점으로는 첫째 매우 산성이거나 염기성인 단백질, 또는 매우 높은 분자량을 가지거나 낮은 분자량을 가진 단백질에 대해서는 분석이 어렵다는 점과, 둘째 조직을 구성하는 주요 단백질인 막단백질의 수용성이 낮기 때문에 이러한 단백질에 대한 분석이 어렵다는 점을 들 수 있다.^2,7) 현재까지 proteomics를 이용하여 혈장 및 뇌척수액, 간, 심장, 전립선, 뇌, 뇌하수체 등 동물 및 인간의 정상조직과 체액 등의 단백질 조성 및 지도(protein reference map)가 발표되었으며, 나아가 간암, 위암, 전립선암 등 암종에서의 단백질 발현양상과 정상조직과의 차이점을 파악함으로써 여러 연구 자료가 보고 되고 있다.²⁾
   저자들은 MALDI-TOF MS를 이용하여 정상 하비갑개조직에 비해 비용조직에서 과발현 혹은 저발현되는 단백질은 vimentin, actin B와 C, annexin A2, keratin 16, fibrinogen beta, serpin B3, glutathion S-transferase(GST) P, coactosin like protein, hemoglobin subunit beta 이었다. 이 중 vimentin, actin, annexin, keratin은 구조 단백질(structual protein)로 알려져 있다. 이러한 단백질들의 기능들은 SWISS-PROT(http://kr.expasy.org/)에서 찾아볼 수 있다. Vimentin은 class III intermediate filaments로 주로 중배엽기원의 구조를 나타내는 구조 단백질로 본 연구에서 정상 코 조직에 비해 비용조직에서 저발현되었다. Actin은 다양한 동형(isoform)들이 존재하는데 본 연구결과에서 정상 코 조직에 비해 비용조직에서 actin C는 저발현된 반면, actin B는 과발현되었다. 이런 결과는 비용의 형성과정에서 actin과 같은 구조 단백질에서 동형들의 변화를 시사한다. Annexin A2는 calcium-regulated membrane binding protein으로의 기능도 가지고 있는며, 세포의 기저막과 세포외기질을 형성하며 비용조직에서 과발현되었다. Keratin 16은 intermediate filament로 세포의 성장에 관여하며 비용에서 과발현되었다. Serpin B3은 또한 squamous cell carcinoma antigen 1로도 알려져 있으며 serine protease inhibitor로의 역할을 한다.^8,9) Serpin B3은 정상 상피조직에도 존재하나 자궁경부암의 종양표시자로 처음 연구되었으며 두경부암, 식도암, 피부암, 폐암에서도 증가 소견을 보였다.^8,9) 그러나 상피세포암뿐만 아니라 일부 폐질환, 피부질환과 같은 양성 병변에서도 증가하는 소견을 보였다.^8,9) 최근 Izuhara¹⁰⁾에 의하면 천식환자의 혈액에서 serpin B3가 증가되어 있어 천식의 기전에서도 중요한 역할을 할 것으로 보고하였다. Serpin B3은 세포고사(apoptosis)의 억제작용의 기능을 가지고 있어 정상상피조직에서 뿐만 아니라 상피세포암의 성장에도 관여할 수 있다.^8,9) 본 연구에서 비용조직에서 과발현되었다. GSTP는 glutathion대사에 관여하며 산화물에 대한 신체 내 방어작용으로 reactive oxygen species(ROS)의 생성을 억제하는데 중요한 역할을 한다.^11,12) GST은 호흡상피에서 발현되어 독성 물질에 대한 세포방어역할을 하는 것으로 알려져 있다.^11,12) 
   Coactosin like pro-tein은 일명 human F-actin binding protein으로도 알려져 있으며 actin filaments를 보다 강하게 결합시켜 세포 구조를 유지시킨다.^13,14) 또한 최근 5-lipoxygenase 효소를 도와 leukotriene A4 생성을 증가시킨다는 보고도 있다.¹⁵⁾ 본 연구에서 비용조직에서 GSTP와 Coactosin like protein이 과발현되었다. Hemoglobin은 두 개의 alpha chains과 두 개의 beta chains의 subunit로 구성되어 산소 운반에 관여한다. Fibrinogen은 alpha, beta, 그리고 gamma가 존재하며 혈액 응고 과정에서 fibrin의 전구물질이고, 혈소판 응집에 cofactor로서 작용한다. 본 연구에서 hemoglobin subunit beta와 fibrinogen beta는 비용조직에서 저발현되었다. 그러나 향후 나머지 단백질 반점에 대한 분석도 필요할 수 있겠다.

결     론

   본 실험은 proteomics를 이용하여 정상 하비갑개조직과 비용에서의 단백질 발현양상을 비교분석하여 정상조직에 비해 비용에서 과발현 혹은 저발현되는 각각 6개씩 총 12개의 단백질을 확인하였다.
   본 연구의 결과를 통해 첫째, 발병의 원인이 잘 알려지지 않은 비용의 발생 기전을 밝혀내는 연구들의 토대가 되는 예비적 기초 자료로 사용되기를 바라며, 둘째, 명백히 기능이 알려지지 않은 새로운 단백질들을 탐색하여 비용의 치료에 도움이 되는 방법을 제시함에 조금이나마 기초자료로 사용되기를 바란다.

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