교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명 5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(053) 620-3781 · 전송：(053) 628-7884 · E-mail：ydkim@med.yu.ac.kr

서     론

   악성림프종은 인체의 면역계에서 발생하는 악성종양으로 주로 림프구에서 기원하며 드물게 형질세포에서 유래하는데, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)과 호지킨 병(Hodgkin's disease)으로 크게 분류되며, 림프절외 부위에서도 발생한다.
   악성림프종의 발생에 대해서는 다양한 원인인자들이 제기되고 있다. 이 가운데 림프절외 악성림프종의 원인으로는 herpes virus, c-type retrovirus 및 Epstein-Barr virus(EBV) 등과 같은 virus에 의한 원인이나 변형유전자 및 종양유전자 등의 유전적인 원인이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾
   EBV는 주로 림프계 세포, 특히 B 림프구를 감염시키며, 또한 인두의 상피세포를 감염시킨다.²⁾ EBV에 감염된 세포는 여러 종류의 EBV 유전자 산물에 의하여 원종양유전자(proto-oncogene)인 bcl-2가 발현되어 불멸화(immortalization)과정이 이루어지며, 이로 인해 세포표면의 표현형과 상피세포의 분화반응에 변화가 생겨 EBV와 연관된 악성종양 발생에 관여한다.^3,4,5)
   종양억제유전자(tumor suppressor gene)는 정상적인 세포에서 무분별한 세포의 분열과 성장을 억제하는 기능을 가진 유전자로, 그 기능이 소실되면 정상세포가 암세포로 변환된다. 이 중 p53 유전자의 산물인 p53 단백은 세포의 핵에 존재하는 인단백으로서 세포주기를 조절하여 과다한 세포증식을 억제하며, 종양억제유전자 중 그 변이가 가장 흔하다.⁶⁾
   한편, 두경부에서 주로 발생하는 림프절외 악성림프종에 대한 발병요인 중 EBV와 bcl-2 단백 및 p53 단백과 관련된 유전자 변이에 관한 연구가 아직 부족한 실정이다. 본 연구는 병리학적으로 미국의 National Cancer Institute의 Working Formulation으로 분류된 림프절외 악성림프종 조직에서 T 세포 및 B 세포 유형을 구분하여 revised European-American classification of lymphoid Neoplasm(REAL classification)을 이용하여 다시 분류한 후,⁷⁾ in situ hybridization(ISH)을 통하여 Epstein-Barr virus mRNA 중 하나인 Epstein-Barr virus encoded RNA(EBER)를 검출하고 면역조직화학적 염색을 통하여 bcl-2 단백 및 p53 단백의 발현을 관찰하여 림프절외 악성림프종의 발암기전 중 EBV와 bcl-2 및 p53에 대한 상호 관련성을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

   1986년 2월부터 1996년 8월까지 11년 6개월 동안 본원에서 조직검사상 두경부 영역에서 림프절외 악성림프종으로 진단되고 병리학적으로 미국의 national cancer institute의 working formulation으로 분류된 40예를 대상으로 하였다. 
   남자는 총 40예 중 29예(72.5%)였고 여자가 11예(27.5%)였다. 남녀 비는 2.6：1로 남자가 많았다. 환자의 연령은 8세에서 74세 사이였고 평균연령은 46.6세였으며 50대가 40예 중 12예(30%)로 가장 많았다.
   종양의 부위별 위치는 40예 중 구개편도가 17예(42.5%)로 가장 많았고, 비강이 9예(22.5%), 비인강이 4예(10.0%), 설저부 및 타액선이 각각 3예(7.5%), 구인강 및 후두가 각각 2예(5.0%) 순이었다.
   종양의 병리학적 분류는 REAL classification을 기준으로 Diffuse large B cell이 14예(35.0%)로 가장 많았고 peripheral T cell lymphoma, unspecified medium sized는 9예(22.5%), angiocentric lymphoma는 7예(17.5%), peripheral T cell lymphoma, unspecified large cell은 6예(15.0%), peripheral T cell lymphoma, unspecified mixed medium and large cell은 3예(7.5%), follicular center lymphoma, diffuse, predominantly small cell은 1예(2.5%)순이었다.

T 세포와 B 세포의 염색
   T 세포 및 B 세포의 염색은 각 증례의 생검조직 중 형태학적으로 가장 보존된 파라핀 포매 블록 한 개를 선택하여 4 μm 두께로 절편을 만들어 poly-L-lysine을 도포한 슬라이드에 부착하였다. 100% xylene으로 실온에서 2분간 4회 파라핀을 제거한 후 100%, 90% 및 75% 알코올을 차례로 이용하여 재수화 하였다. 항원 부활을 위해 0.21% citric acid 용액에 조직편을 넣고 microwave oven에서 5분간 2회 가열하였다. 조직 내의 내인성 과산화효소를 제거하기 위해 3% 과산화수소수에 15분간 처리한 후 Tris 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척한 다음 비특이 단백의 결합을 제거하기 위하여 blocking kit(Zymed, San Francisco, CA)를 사용하여 실온에서 30분간 반응시킨 후, Tris 완충액으로 3분씩 3회 세척하였다.
   일차항체는 각각 Monoclonal Mouse Anti-Human CD3 antibody(CD3, DAKO, Carpinteria, CA)와 Monoclonal Mouse Anti-Human CD20 antibody(CD20 cy, DAKO)를 각각 1：70, 1：60으로 희석하여 사용하였으며 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. 그 후 LSAB kit(DAKO)를 이용하여 이차항체를 30분간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. Streptavidin-HRP(Zymed)를 30분간 도포하여 biotin-avitin 특이 결합을 유도하였다. Tris 완충액으로 다시 3회 세척한 다음 3-amino-9-ethyl carbazole(AEC)(Zymed)을 10분간 도포하여 발색하였고 10% Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하였다.

Epstein-Barr virus encoded RNA(EBER)의 검출
   EBER을 검출하기 위하여 In situ hybridization(ISH)법을 사용하였다. 파라핀 포매 블록을 3 μm 두께로 박절한 다음 0.1% DEPC(diethylpyrocarbonate) 용액에 띄운 후 슬라이드(Probe On Plus slide, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)에 부착하여 실온에서 건조시켰다.
   ISH의 모든 과정은 Probe On Plus slide를 맞대어 생기는 capillary gap의 원리를 이용하여 염색하는 MicroProbe System(Fisher Scientific)를 이용하였다. 박절편이 부착된 각 슬라이드를 2장씩 짝을 지어 슬라이드 홀더에 끼운 후 dewaxing 용액에 100℃에서 2분간, 4번 반복하여 파라핀을 완전히 제거하였다. 10배 농도의 immuno/DNA 완충액(Research Genetics, Huntsville, AL)으로 세척 한 다음 pepsin(Research Genetics)으로 100℃에서 3분간 부란시켰다. 그 후 probe(EBV EBER, Research Genetics)로 100℃, 85℃ 및 65℃에서 차례대로 3분, 3분 및 20분간 부란시켰으며 각각 1분간씩 식혔다. 부란과정이 끝난 후 Posthybe 용액(Research Genetics)으로 3회 세척한 후 Streptavidin-AP(Research Genetics)를 50℃에서 3분간 반응시켰다. FRT(Research Genetics)로 50℃에서 10분간 발색시킨 후 10배 농도의 immuno/DNA 완충액(Research Genetics)으로 세척한 다음 10% Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하였다. 양성 대조군은 poly T probe(Research Genetics)를 이용하였다.

bcl-2와 p53 단백의 염색
   bcl-2 단백의 염색은 비특이 단백의 결합을 제거하기 위하여 blocking kit(Zymed)을 사용하는 단계까지 T 세포 및 B 세포 염색과 같은 방법으로 시행하였다. 일차항체는 bcl-2 124(DAKO)를 1：50으로 희석하여 사용하였으며 4℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. 그 후 LSAB kit(DAKO)를 이용하여 이차항체를 30분간 반응시킨 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. Streptavidin-HRP(Zymed)를 30분간 도포 후 Tris 완충액으로 3회 세척한 다음 AEC를 10분간 도포하여 발색하였고 10% Mayer's hematoxylin으로 대조 염색하였다.
   p53 단백의 염색의 전 과정은 Bcl 2 단백 염색과 동일한 방법으로 실시하였다. 일차항체는 BP53.12(Zymed)를 1：50으로 희석하여 사용하였다.

양성 판정기준
   양성 판정기준은 매 염색 시마다 양성 대조염색을 시행하였고 T 세포 및 B 세포는 종양세포의 일부분에서라도 세포질이 분명히 적색으로 염색되면 양성으로 판독하였다. EBER은 종양세포의 일부분에서라도 핵과 세포질이 진한 적색으로 염색되면 양성으로 판정하였다. bcl-2 단백은 종양세포들의 일부분에서라도 세포막과 세포질이 진한 적색으로 염색되면 양성으로 판정하였다. p53 단백은 5% 이상의 종양세포에서 핵이 분명히 갈색으로 염색되면 양성으로 판정하였으며 5% 미만은 야생형 p53의 발현을 배제하기 위해 음성으로 판정하였다.⁸⁾ EBER과 bcl-2 단백 및 p53 단백의 판정은 양성과 음성 두 가지로 하였으며 염색의 강도에 따른 구분은 하지 않았다.

통계분석
   EBER과 bcl-2 단백 및 p53 단백의 발현과 발암기전과의 상호관련성은 SPSS/PC+프로그램을 이용하여 χ²-test로 검정하였으며 유의수준은 0.05 이하로 통계분석을 하였다.

결     과

EBER의 발현
   EBER의 발현은 40예 중 20예(50%)에서 양성이었고 주로 종양세포의 핵과 세포질이 진한 적색으로 염색되었다(Table 1, Fig. 1). T 세포 양성 24예 중 EBER이 양성으로 나타난 경우는 11예(45.8%), B 세포 양성 16예에서는 9예(56.3%)가 EBER 양성으로 나타났는데, 두 군간 EBER 양성률의 차이는 통계적으로 유의성이 없었다(Table 2)(p>0.05). 또한 EBER 양성과 환자의 성별, 연령, 종양의 위치와 병리학적 분류는 관련성이 없었다(p>0.05).

bcl-2 단백의 발현
   bcl-2 단백의 발현은 40예 중 17예(42.5%)에서 양성이었고 주로 종양세포의 세포질이 진한 적색으로 염색되었으며 주위조직에서는 나타나지 않았다(Table 1, Fig. 1). bcl-2 단백의 발현과 환자의 성별, 연령, 종양의 위치와 병리학적 분류는 관련성이 없었다(p>0.05).

p53 단백의 발현
   p53 단백의 발현은 40예 중 23예(57.5%)에서 양성이었고 주로 종양세포의 핵이 진한 갈색으로 염색되었으며 주위 조직에서는 나타나지 않았다(Table 1, Fig. 1). p53 단백의 발현과 환자의 성별, 연령과 종양의 위치는 관련성이 없었다(p>0.05). 그러나 병리학적 분류에서는 angiocentric lymphoma type 7예 중 6예(85.7%), peripheral T cell lymphoma unspecified large cell type 6예 중 5예(83.3%)로 다른 형태보다 높게 나타나 통계학적으로 유의성이 있었다(Table 3)(p<0.05).

EBER, bcl-2 단백 및 p53 단백 발현의 상호관련
   EBER, bcl-2 단백 및 p53 단백 발현의 상호관련성을 살펴보면 EBER 양성군 20예에서 bcl-2 단백 양성은 9예(45.0%), p53 단백 양성은 11예(55.0%)로 상호관련성은 없었다(Table 4)(p>0.05). bcl-2 단백 양성군 17예에서 p53 단백 양성은 9예(52.9%), bcl-2 음성군 23예 중 p53양성은 14예(60.9%)로 나타났으며, p53 단백 양성군 23예 중 bcl-2 양성은 9예(39.1%), p53음성군 17예 중 bcl-2 양성군은 8예(47.1%)로 p53과 bcl-2의 발현 간에는 어떠한 유의성도 없었다(Table 5)(p>0.05).

고     찰

   악성림프종은 인체의 면역계에서 발생하는 악성종양으로 두경부의 비상피암종 중 가장 흔하다. 많은 예에서 두경부의 림프절 종대를 동반하며 경부 종괴로 내원한 환자 중 4.2~5.4%, 두경부 악성종양의 1.4~11.1%를 차지하여 두경부 종양학에서 매우 중요한 질환이다.^9,10) 또한 형태학적 및 조직학적 유형에 따라 임상경과와 예후가 다르기 때문에 이에 따른 분류를 통해 치료와 예후 판단에 도움을 줄 수 있으며, 최근에는 분자생물학과 면역조직화학기법의 발달로 단클론 항체(monoclonal antibody)를 이용하여 악성림프종을 면역학적으로 분류하고 있다.
   악성림프종의 성별분포는 남자에서 호발하며 림프절외 두경부 영역에서는 Waldeyer's ring에 가장 많이 발생하는 것으로 알려져 있다.^11,12) 본 연구에서도 림프절외 악성림프종이 남자에서 여자보다 2.6배 많았고 구개편도가 17예(42.0%)로 가장 많았으며 REAL classification상 diffuse large B cell이 14예(35.0%)로 가장 많아 Tae 등¹²⁾과 유사한 결과를 보였으나 병리학적 분류와 종양의 위치와는 의미 있는 관련성이 없었다(p>0.05).
   EBV는 herpes virus에 속하는 이중쇄 DNA virus로서 150~180 nm 크기이며, EBV genome은 175 kb의 크기이다. 감염은 구인두에서 시작하여 타액선 및 인두의 상피세포와 림프계 조직에서 증식이 일어난다.²⁾ Suh 등은 우리나라 건강인의 비인강 조직에서 중합효소 연쇄반응을 이용하여 EBV DNA가 62.9%가 검출되고,¹³⁾ Shin 등은 만성 편도염과 비후된 편도 조직에서 ISH을 이용하여 79%에서 EBV가 검출된다고 보고하였으나,¹⁴⁾ Feinmesser 등은 정상 편도에서 EBV가 검출되지 않는다고 보고하였다.¹⁵⁾ 이와 같이 EBV의 검출률이 보고자에 따라 서로 다른 차이를 보이는 것은 지역과 인종적 차이 및 실험방법이 다르기 때문일 것으로 생각된다.
   본 연구에서는 EBV의 검출방법으로 신속하고 민감성이 높으며 파라핀 포매조직에서도 이용 가능한 ISH을 통하여 EBER의 존재를 확인하였다. EBER은 단백을 생성하지 못하고 주로 잠복상태로 존재하는 감염세포에서 1개 세포 당 106정도의 많은 양이 생성되어 La protein과 결합하여 ribonucleoprotein particle로 존재하여 감염세포의 핵 내에서 복제, 전사 및 RNA processing의 과정에 관여하며 감염세포의 불멸화과정에 관여할 것으로 생각된다.^3,16)
   비호지킨 림프종에서 ISH법으로 EBER을 검출한 연구에서는 T 세포 악성림프종에서는 매우 높게 발현되며 B 세포 악성림프종에서는 거의 발현되지 않는다는 보고가 많다.^3,11,17) 본 연구에서도 ISH법으로 EBER의 검출한 결과 40예 중 20예(50%)에서 양성으로 나타나 림프절외 악성림프종의 발생기전은 EBV와 연관성이 있을 것이라 생각되나 EBV 검출이 종양세포와 정상세포 모두에서 가능하기 때문에 EBV의 존재가 종양발생에 일차적 역할을 하는지 아니면 단순히 잠복감염에서 재활성화되는 것인지는 알 수 없었다. 또한 T 혹은 B형 악성림프종에 따른 EBER의 검출률은 다른 보고자와 달리 차이가 없었다.
   고사에 관여하는 bcl-2 유전자는 26 kDa 크기의 단백산물을 생성하고, 정상적으로 염색체 18번의 장완 band 21(18q21)에 위치하며, 주로 세포내 사립체막에 분포한다. bcl-2 단백은 세포들의 면역반응 기억세포군을 유지시키고 상피세포의 성장과 분화를 조절하는 기능을 한다. bcl-2 단백이 과발현되면 death promoter인 BAX와의 상호균형이 깨어지면서 고사를 억제하여 세포수명을 연장시킴으로써 세포로 하여금 성장 및 증식 암유전자나 종양억제유전자와 같은 암유전자로부터 추가적인 영향을 받을 수 있는 기회를 증가시켜 악성 형질전환이 용이하게 한다.⁵⁾ 종양조직에서의 bcl-2 단백의 발현은 여포성 림프종, 림프세포증식성 장애, 비인강 미분화종 등에서 발현되고 EBV 감염 시 EBV에 감염된 세포주의 생존기간을 연장시키거나 c-myc과 같은 다른 암유전자들과 반응하여 종양을 유발시킬 수 있으나,^3,4,5,18) 악성림프종에서 EBV 감염과 bcl-2 단백 발현과는 상호관련성이 없다는 연구 결과도 있다.^1,19) 본 연구에서는 bcl-2 단백 발현이 EBER 양성군 20예 중 9예(45.0%)에서만 양성으로 나타나, EBV와의 관계는 상호관련성은 없는 것으로 생각된다.
   세포의 분화와 성장에 관계된 p53 종양억제유전자는 17번 염색체의 단완에 존재하며 여러 종양바이러스들이 p53 유전자를 파괴하거나 그 기능을 억제하여 종양의 생성이 유도되는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, EBV의 LMP-1에 의해 bcl-2 단백이 상향조절(upregulation)되면 p53 단백에 의한 고사의 유도가 억제되어 EBV가 세포의 형질전환에 기여하고 있음이 알려져 있으나,⁵⁾ EBV 감염과 p53 단백 발현은 상호관련성이 없다는 보고도 있다.²⁰⁾ 본 연구에서는 p53 단백 발현은 40예 중 23예(57.5%)에서 양성으로 관찰되어 림프절외 악성림프종 발암기전과는 관련이 있을 것으로 추정되나, EBER 양성군 20예에서 p53의 양성 발현은 11예(55.0%)로 EBV감염과 p53단백의 생성은 상호관련성이 없는 것으로 나타났다.
   한편, 종양의 발생에서 bcl-2 단백의 발현과 p53 단백의 발현과의 관계는 p53 단백 발현과 관계없이 bcl-2 단백은 독립적으로 발현될 수 있다고 알려져 있는데,⁵⁾ 본 연구에서도 bcl-2 단백의 양성 발현군 17예에서 p53의 양성 발현은 9예(52.9%)로 각각 독립적인 경로로 림프절외 악성림프종의 발생에 관여하는 것으로 생각되나 보다 더 많은 대상군을 이용한 연구가 필요하며 이와 함께 EBV와 p53 및 bcl-2 단백의 발현이 림프절외 악성림프종의 치료 및 예후에 미치는 영향에 대해서도 추가적인 연구가 필요하다.

결     론

   림프절외 악성림프종에서 EBER과 bcl-2 단백 및 p53 단백의 양성 발현율은 각각 50.0%, 42.5% 및 57.5%로 나타났으며 EBV 감염과 bcl-2 단백의 발현 및 p53 단백의 발현과의 상호관계는 통계학적 유의성이 없었다. 따라서 악성림프종의 발암기전에 있어 EBV와 bcl-2 단백 및 p53 단백은 각각 독립적으로 작용할 것으로 생각된다.

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