교신저자：이강대, 602-702 부산광역시 서구 암남동 34번지  고신대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   제 1 형 다발성 내분비선종증(multiple endocrine neoplasia typeⅠ, MENⅠ)은 원발성 부갑상선 기능 항진증, 뇌하수체와 췌장의 호르몬 분비과다 및 신경내분비성 종양으로 특징지워지는 질환으로서 상염색체 우성으로 유전된다. 최근까지 MEN Ⅰ의 진단은 전형적인 가족성 내분비 질환의 특성을 밝혀내고, 이에 대한 호르몬, 전해질 등의 선별검사를 하는 것에 국한되어져 왔다. 그러나 이러한 진단방법은 MEN Ⅰ과 관계없는 산발적인 내분비 질환의 경우에서 10% 이상 위양성률을 보이며, 위음성률도 높아 선별검사가 제대로 이루어지지 않고 있다.¹⁾ 따라서 1997년 Guru 등²⁾에 의해 MEN Ⅰ유전자가 발견된 이후, MEN Ⅰ유전에 대한 분자 유전학적 검사에 대한 관심이 세계적으로 높아져 가고 있다. 
   MEN Ⅰ유전자는 종양억제유전자로, MEN Ⅰ유전자의 유전적인 변이(first hit)와 불활성적 변이(second hit)의 병합으로 인해 MEN Ⅰ이 발생하는 것으로 이해되고 있다.³⁾ 이 유전자는 10개의 exon으로 되어있으며 610개의 아미노산으로 구성된 menin이라는 단백질을 생산한다.²⁾ Menin은 세포핵내 단백질이며, menin의 변이는 종양억제유전자로서의 기능을 잃게하여 MEN Ⅰ이 발생한다고 추측하고 있으나 정확한 menin의 기능에 대해서는 불확실하다. 
   유전자 변이 검사를 통한 MEN Ⅰ의 진단은 기존의 이온화 칼슘과 부갑상선 호르몬, 가스트린, 그리고 프로락틴 등을 이용한 생화학적 선별검사의 단점을 극복할 수 있으며 더욱 정확한 진단이 가능하다. 그리고 무엇보다 MEN Ⅰ환자의 가족특이 유전변이에 대한 선별검사는 다른 가족 구성원에 대한 유전 분석을 도와 무증상의 유전변이 보유자에 대한 조기진단과 치료를 가능하게 한다. 그러나 아직 국내에서는 분자 유전학적 검사를 통한 MEN Ⅰ의 유전변이가 보고된 예가 없다. 따라서 저자들은 MEN Ⅰ지표환자(index patient)와 가족에 대한 유전자 변이 검사를 통해 MEN Ⅰ유전변이를 알아보고자 하였다. 

대상과 방법

대  상
   42세 남자 환자가 재발성의 요관과 신장결석으로 고신대학교 복음병원에서 치료 및 경과 관찰 중 지속적으로 칼슘, 가스트린, 글루카곤과 프로락틴 혈중 농도가 높게 측정되었다(Table 1). 이후 환자에 대하여 방사선학적 검사를 시행하여 Tc-99m MIBI 스캔에서 우측 하부갑상선의 비정상적인 지연성 흡수소견이 있어 부갑상선 선종을 의심하였으며, 자기공명영상에서 뇌하수체 선종이, 신장 초음파상 양측 상부요관 및 신장에서 다발성 종물이 발견되었다(Fig. 1). 또한 환자의 가족력상 친모에서 재발성의 요관과 신장의 결석이 있었다. 이와같은 임상학적 소견에 따라 MEN Ⅰ으로 진단을 내리고, 환자(지표환자)에 대하여 유전자 분석(DNA sequencing)을 통해 MEN Ⅰ에 대한 점돌연변이의 유무에 대해 알아보았다. 이 환자를 통해서 확인된 점돌연변이의 결과를 바탕으로 지표환자의 가족 중 검사가 가능하였던 16세 아들과 15세 딸에서도 유전자 변이를 알아보기 위해 말초혈액 내 백혈구를 추출하여 DNA 염기서열 분석을 시행하였다(Fig. 2).

DNA 추출과 중합효소 연쇄반응
   3명의 가족구성원의 말초혈액 백혈구를 DNA 추출기 WB kit(Wako Chemicals, Tokyo, Japan)를 이용하여 고분자량 DNA를 추출하였다. MEN Ⅰ 유전자의 exon을 포함하는 oligonucleotide primer를 DNA synthesizer model 8700(Biosearch, San Rafael, CA, USA)을 이용하여 DNA를 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응은 100 ng template DNA, 1.0 또는 1.5 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTP, 각각의 sense, antisense primer 5 pmol, 1 unit의 Taq polymerase (Amersham, Tokyo, Japan)의 농도로 구성된 완충액에 넣어서 총 50 μL의 반응액을 PC-700 programme thermal cycler (Astec, Tokyo, Japan)를 이용하여 시행하였다. 중합효소 연쇄반응 조건은 94℃에서 3분간 초기 변성시킨 후 94℃에서 30초간 변성반응(denaturation), 55℃에서 30초간 결합반응(annealing), 72℃에서 7분간 연장반응(extension) 후 72℃에서 1분간 polymerase 반응을 35회 반복하였다.

염기서열 분석
   중합효소 연쇄반응 산물은 96% 포름아마이드, 20 mM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.05% 자이렌시아놀로 구성된 용액에 희석하였다. 희석된 용액 20 μL 표본은 85℃에서 3분동안 변성하고 12% 중성 폴리아크릴아마이드 겔과 10% 포름아마이드와 함께 30 watt로 3시간 내지 5 시간 동안 전기영동을 시행하였다. 전기영동 후 DNA는 은염색 방법(Daiichi Pure Chemicals, Tokyo, Japan)으로 확인하였다. 요약하면, 겔은 10% 트리클로로아세트산으로 20분간 처리한 후 실온에서 10분간 50% 메탄올로 고정하였다. 그 다음 겔은 5분간 증류수로 세척하고 15분간 10% 은염색 용액에 배양하였다. 증류수로 두세번 간단하게 세척한 후 5% 현상액에서 현상하고 10분간 현상정착액(stop solution)에서 세척한 후 탈이온화된 용액으로 두세번 5분간 세척하였다. 겔은 겔 드라이어를 이용하여 여과지를 통해 건조시켰다. SSCP(single strand conformation polymorphism)분석법으로, 정제된 부산물은 Fluorescence-based dideoxy terminator cycle sequencing(Applied Biosys-tems, Weiterstadt, Germany)를 이용하여 25회 이상 중합효소 연쇄반응을 하였다. 이 부산물은 Centri-sepspin-column(Applied Biosystems)을 통해 추출하고, 모세 겔 전기영동하였다. 자료수집과 분석은 자동 DNA sequencer(Model 310, Applied Biosystems)로 시행하였다. 모든 중합효소 연쇄반응을 반복적으로 시행함으로써 MEN Ⅰ유전변이의 존재유무 판정에 신뢰도를 높이도록 하였다.

결     과

염기서열
   임상 소견과 가족력상 MEN Ⅰ으로 진단한 지표환자의 백혈구로부터 DNA를 추출하여 유전자 검사를 한 결과, MEN I 유전자 exon 7의 splice acceptor site에서 뉴클레오티드 1023의 a가 g로 전이(a→g transition)되는 점돌연변이가 확인되었다. 또한 지표환자의 아들, 딸에게서 모두 동일한 부위에서 MEN Ⅰ유전자의 점돌연변이를 확인하였다(Fig. 3).

수술적 치료와 술후 경과관찰
   지표환자에게 요관 결석 제거술과 부갑상선 제거술을 시행하였다. 술 후 부갑상선의 조직병리학적 소견은 미만성의 주세포와 혈관이 증식하여 부갑상선의 선종임이 확인되었다(Fig. 4). 이후 칼슘과 인의 혈중 농도는 정상화되었다. 또한 뇌하수체의 프로락틴 분비 선종으로 의심되는 종괴는 제거수술을 시행할 예정이며, 가스트린과 글루카곤의 비정상적인 높은 혈중 농도로 인하여 췌장의 분비성종양이 의심되어 복부의 방사선학적 검사를 시행하고 필요할 때 복부수술도 시행 예정이다.
   지표환자의 자녀에 대해서는 유전자 변이 검사결과에 따라 증상이 없는 MEN Ⅰ유전변이 보유자로 확인되어 부갑상선과 췌장, 뇌하수체의 방사선학적 검사 및 전해질과 호르몬 검사를 시행하고 치료를 할 예정이다. 

고     찰

   MEN Ⅰ은 부갑상선, 췌도세포 및 뇌하수체 전엽에 다발성 종양이 발생하는 신경 내분비성 종양군이다. 그 외에 카르시노이드 종(carcinoid tumor) 또는 지방성 종양이 나타나는 Wermer 증후군으로도 불리기도 하는데,⁴⁾ 이 질환은 산발적으로 혹은 가족적으로 발생하며 상염색체 우성으로 유전된다. 침범되는 내분비 기관으로는 부갑상선이 80%에서 95%로 가장 많은데, 부갑상선 기능항진증은 대부분의 MEN Ⅰ에서 처음 발견되는 중요한 임상소견이다.⁵⁾ 부갑상선기능 항진증은 MEN Ⅰ의 고위험군에서 선별검사로 매년 이온화 칼슘과 부갑상선 호르몬 검사를 시행했을 경우 평균 19세에 진단되며 대개의 경우 부갑상선 기능 항진증이 40세까지는 진단된다. 즉 MEN Ⅰ은 산발적인 발생의 경우 일반적으로 30대에 진단되는 것으로 알려져 있으나 가족력이 있는 경우 호르몬이나 전해질 등을 이용한 전향적 선별검사를 실시하면 진단연령을 낮출 수 있다. 따라서 현재 좋은 예후를 기대하기 위해 MEN Ⅰ으로 진단된 환자의 가족에 대한 규칙적인 선별검사와 췌장종양이 아직 발현되지 않은 환자에서 췌장 호르몬에 대한 선별검사가 강조되어져 왔다.⁶⁾ 
   그러나 1954년 Wermer⁷⁾가 처음으로 MEN Ⅰ의 상염색체 우성 유전에 대해 보고한 이래, 1997년 MEN I 유전자의 염기서열 분석이 이뤄져²⁾ MEN Ⅰ 환자 및 보유자에 대한 유전학적 선별검사가 가능하게 되었다. 즉 지금까지의 진단방법은 환자 가족들에 대한 소화성궤양, 저혈당, 신결석, 지방종, 뇌하수체기능 저하증 등의 병력 청취와 선별검사로 혈당, 혈청 칼슘과 인, 프로락틴, 가스트린 등을 주기적으로 시행하는 것을 중요하게 여겼지만 최근 MEN Ⅰ이 menin이라 불리는 종양억제유전자의 불활성 변이로 부터 발생하는 것으로 밝혀진 이후 환자의 가족 중에서 발생 위험성이 있는 개체의 발견에 유전자 검색이 중요할 것으로 받아들여지고 있다. 
   분자 생물학적, 유전학적 연구의 발전으로 Larsson 등³⁾에 의해 MEN Ⅰ의 원인이 되는 유전자가 제 11 번 염색체의 장완 13(11q13), PYGM(skeletal muscle glycogen phosphorylase)유전자 근처에 존재하며, 610 아미노산 단백을 암호화한다는 것이 밝혀졌다. 이 유전자는 1개의 비전사 엑손(untranslated exon)과 9개의 암호화된 엑손(coding exon)으로 이루어져 있으며, 정상 MEN Ⅰ유전자는 일종의 종양억제 유전자로서 역할을 하는 것으로, menin의 불활성화 유전과 질환 형태에 대한 유전은 MEN Ⅰ유전자에 의해 전개되고, 종양에서 2번째 대립유전자의 소실을 수반한다.²⁾ 즉 불활성화 유전은 MEN Ⅰ유전자가 종양 억제 유전자임을 보여준다. MEN Ⅰ의 병인론과 발생에 대한 연구를 통해 종양 발생은 환자인 부모로부터 유전된 비정상의 MEN Ⅰ유전자에 덧붙여 정상 MEN Ⅰ유전자가 어떤 이유로 돌연변이를 일으키거나 결손되면 종양이 발생하게 된다는 이중충격 가설(two-hit hyposthesis)이 유력하게 받아들여지고 있다.³⁾ 
   MEN Ⅰ환자에게 있어 유전자 변이 검사는 9개의 coding exon에서 시행하지만 유전자 형태와 질병형태와의 정확한 관계는 아직 밝혀지지 않고 있다.⁸⁾ 지금까지 세계적으로 MEN Ⅰ유전자에서 약 260가지의 변이가 보고 되었으며⁹⁾ 이 변이중 가장 중요한 것은 MEN Ⅰ유전자의 종양억제기능의 불활성화같은, 단백질 부산물에 조기 절단(early termination)을 일으키는 것이다.¹⁰⁾ MEN Ⅰ유전자의 염기서열 분석에서 변이 종류는 약 70%에서 non-sense, frame shift 또는 splicing mutation으로 나타나고, 30%에서 missense나 in-frame mutation이 나타난다.¹¹⁾ 따라서 MEN Ⅰ의 질환 표현형은 MEN Ⅰ유전자의 모든 exon들의 다양한 변이와 연관된다.
   MEN Ⅰ유전자의 변이는 menin의 nuclear localizing signal(NLS)의 소실에 의한 menin의 절단된 형태나 transcriptional factor JunD와의 결합 변환에 의한 것으로 생각되어지고 있다.¹¹⁾ 하지만 MEN Ⅰ유전자의 변이는 coding 부위의 여러 부분의 이상으로 다양한 형태가 생기게 되며, 따라서 대개 모든 MEN Ⅰ가계는 개별적인 변이를 가질 수 있게 되는 것이다. 그중 intron 4의 변이가 모든 MEN Ⅰ변이의 10% 이상으로 가장 흔하게 일어난다.¹²⁾
   한편, menin의 영역(domain)과 표현형(phenotype)과의 관계에 대한 연구가 진행중인데, 최근 Okamoto 등¹³⁾은 MEN Ⅰ유전자의 exon 4의 변이가 췌장의 인슐린종을 일으키는 것을 보고하였으며, Fujimori 등¹⁴⁾은 exon 3과 7사이의 변이가 부갑상선 기능항진증과 특별히 관계가 있음을 보고하였다. 또한 menin은 Jun D-, NF-kappaB-, Smad3- 등의 매개로 전사(transcrpition)가 활성화되는 것이 밝혀져,¹⁵⁾ 활발한 유전자 연구가 이루어지고 있으나 아직 확실한 menin의 기능은 알 수 없는 단계이며 MEN Ⅰ의 다양한 병리학적인 특성으로 인하여 확실히 정의되지 못하고 있는 실정이다. 다만 현재 menin의 기능과 연관되어 알려진 단백질은 JunD, NF-kappa N, Smad 3, Pem, Nm23H1, glial fibrillary acidic protein, Vimentin과 P53 정도이다.¹⁶⁾
   국내에서는 1가족에서 2예의 가족성으로 발병한 보고가 있었으나,¹⁷⁾ 대부분 환자 가족들에서 선별검사가 제대로 이루어지지 않았고 유전자 검색을 시행했던 예는 없었다. 본 연구에서는 MEN Ⅰ환자의 가계에서 MEN Ⅰ유전자 변이 분석을 시행한 결과 exon 7 이하의 splicing acceptor site 뉴클레오티드 1023의 a가 g로 전이(a→g transition)되는 점돌연변이를 발견하였다. 따라서 전체 exon 7에 해당하는 부위의 돌연변이로 인해 비정상적으로 전사가 종료되고, menin이 정상보다 짧아지는 결과를 초래하여 이 단백질의 종양억제기능을 상실함으로서 MEN Ⅰ이 발생한 것으로 생각된다. 
   세계적으로 MEN Ⅰ유전자 변이가 보고되지만 본 연구에서 밝혀진 것과 같은 유전자 변이는 서구에서는 아직 발견된 보고가 없고 최근 일본의 뇌하수체 선종환자의 가계에서 동일한 돌연변이를 보고한 바 있다.¹⁸⁾ 최근 DNA 분석의 유용성에 대한 연구가 많이 이루어짐에 따라 임상적, 생화학적 검사에 이상이 나타나기 전에 유전자분석을 이용하여 질환 보유자를 찾아내면 MEN Ⅰ환자에게서 조기에 치료를 할 수 있으므로, MEN Ⅰ가계에서는 환자의 백혈구에서 추출한 DNA에서 유전변이 여부를 선별검사하는 것이 중요할 것으로 생각된다. 

결     론

   국내에서는 아직 MEN Ⅰ가계에 대한 체계적인 유전적 분석이 어려운 실정이지만 유전자를 이용한 선별검사가 철저히 시행된다면 MEN Ⅰ환자 및 임상증상이 발현되지 않은 가족들의 유전상담을 돕고 조기에 진단함으로써 질병의 치료에 도움을 줄 뿐만 아니라 예후를 향상시킬 수 있을 것으로 생각된다. 또한 아직까지 명확하지 않은 MEN Ⅰ의 유전변이와 다양한 질환양상에 대한 문제는 적극적인 분자 유전학적인 검사를 통하여 이 질병의 분자적 기초를 이해하여 보다 나은 치료에 대한 발전을 기대할 수 있을 것이다. 

1. Burgess JR, Greenaway TM, Shepherd JJ. Clinical and genetic correlates in a large MEN 1 family. Endocrine Society of Australls, Annual Scientific meeting: Canberra;1997.

2. Chandrasekharappa SC, Guru SC, Manickam P, Olufemi SE, Collins FS, Emmert-Buck MR, et al. Positional cloning of the gene for multiple endocrine neoplasia-type 1. Science 1997;276:404-7.

3. Larsson N, Skogsed K, Oberg Y, Nakamura M, Nordenskjold M. Multiple endocrine neoplasia type 1 gene maps to chromosome 11 and is lost in insulinoma. Nature 1988;332:85-7.

4. Lips CJ, Vasen HF, Lamers CB. Multiple endocrine neoplasia syndromes. Crit Rev Oncol Hematol 1984;2:117-84.

5. Benson L, Ljunghall S, Akerstrom G, Oberg K. Hyperparathyroidism presenting as the first lesion in multiple endocrine neoplasia type 1. Am J Med 1987;82:731-7.

6. Skogsed B, Rastad J, Oberg K. Multiple endocrine neoplasia type 1, clinical feature and screening. Endocrinol Metab Clin North Am 1994;23:1-17.

7. Wermer P. Genetic aspects of adenomatosis of endocrine glands. Am J Med 1954;16:363-71. 

8. Agarwal SK, Kester MB, Debelenko LV, Heppner C, Emmert-Buck MR, Skarulis MC, et al. Germline mutations of the MEN1 gene in familial muliple endocrine neoplasea type 1 and related states. Hum Mol Genet 1997;6:1169-75.

9. Thakker RV. Multiple endocrine neoplasia type 1. Endocrinol Metab Clin North Am 2000;29:541-67.

10. Pearon ER. Tumor Suppressor genes. In: Vogelstein B, Kinzler KW, editors. The genetic basis of human cancer. New York: McGraw-Hill; 1998. p.229-36.

11. Pannett AA, Thakker RV. Multiple endocrine neoplasia type 1. Endocr Relat Cancer 1999;6:449-73.

12. Turner JJ, Leotlela PD, Pannett AA, Forbes SA, Bassett JH, Harding B, et al. Frequent occurrence of an intron 4 mutation in multiple endocrine neoplasia type 1. J Clin Endocrinol Metab 2002;87:2688-93.

13. Okamoto H, Tamada A, Hai N, Doi M, Uchimura I, Hirata Y, et al. A novel six-nucleotide insertion in exon 4 of the MEN1 gene, 878ins-CTGCAG, in three patients with familial insulinioma and primary hyperparathyroidism. Jpn J Clin Oncol 2002;32:368-70.

14. Fujimori M, Shirahama S, Sakurai A, Hashizume K, Hama Y, Ito K, et al. Novel V184E MEN1 germline mutation in a Japanese kindred with familial hyperparathyroidism. Am J Med Genet 1998;80:221-2.

15. Chandrasekharappa SC, Teh BT. Functional studies of the MEN1 gene. J intern Med 2003;253:606-15.

16. Poisson A, Zalblewska B, Gaudray P. Menin interacting proteins as clues toward the understanding of multiple endocrine neoplasia type 1. Cacer Lett 2003;189:1-10.

17. Bin JS, Lim SH, Kim BT, Choi MG, Jang YB, Yu HJ, et al. The multiple endocrine neoplasia type I in sisters. Korean J Internal M Suppl I 1993;45:236.

18. Tanaka C, Yoshimoto K, Yamada S, Nishioka H, Ii S, Moritani M, et al. Absence of germ-line mutations of the multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN 1) gene in familial pituitary adenoma in contrast to MEN1 in japanese. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:960-5.