교신저자：김동욱, 140-743 서울 용산구 한남동 657번지  순천향대학교 의과대학 순천향병원 이비인후과학교실
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서     론

   알레르기 비염은 IgE와 관련된 항원-항체 반응에 의한 반응으로 주로 비만세포의 활성과 화학물질의 분비로부터 시작된다. 이미 형성된 히스타민, 트립신분해효소, 헤파린, chymase 등의 분비와 새로이 합성된 prostaglandin D2(PGD2)나 leukotrienes(LTs)에 의한 증상들이 나타난다. 그 후 호산구가 동원되며, 종국에는 과민반응과 비점막 조직의 불가역성 변화를 초래하게 된다.¹⁾
   알레르기 비염에서 가장 중심적인 역할을 하는 비만세포는 모든 조직에 분포하고, 비강에서는 비만세포에서 분비되는 여러 종류의 물질이 점막과 점막하층에 분포하는 감각신경 말단과 혈관에 직접 작용하여 재채기나 비루를 유발한다.²⁾ 또한 알레르기 비염 환자에서 비만세포는 고유층과 표층에서 화학매개체(LTs, platelet activating factor(PAF), 히스타민, eosinophil chemotactic factor와 neutrophil chemotactic factor를 분비하며, B-cell의 활성화와 국소적인 IgE의 생산을 증가시키고, 호산구와 호염기구의 유주를 일으켜 염증반응을 유발한다. 분비된 히스타민, protease, 헤파린과 TNF-α는 콜라겐 합성을 유도하여 조직의 재형성(remodelling)에 관여한다. 단백 분해효소인 트립신분해효소와 chymase는 조직의 섬유화에 관여하며, 섬유소원의 퇴화와 제 Ⅳ형의 콜라겐을 절단하여 비점막의 재형성에 관여한다.³⁾
   알레르기 비염에서 비폐색은 히스타민, peptide LTs, PAF 그리고 capsaicin sensitive sensory nerve reflex 등이 관여하는데, 이 중 cysteinyl LTs(cysLTs)가 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.⁴⁾
   LTs는 거의 모든 세포에서 염증반응에 관여하는 강한 매개체로, LTB₄의 작용은 주로 면역 작용, 즉 단기 노출시에는 다핵구의 유주를, 지속적 노출시에는 호산구를 포함한 과립백혈구의 유주를 유발한다. CysLTs는 주로 혈관에 작용하며, 혈관 투과성과 세포액의 유출을 증가시키고 조직의 부종을 일으킨다. 특히 LTD₄는 호산구, 비만세포, 단핵구, 호중구, 호염기구 등에서 분비되며, 알레르기 비염에서 후기 반응의 주 증상인 비폐색에 관여한다고 알려져 있다.⁵⁾ LTD₄ 수용체는 cysLT₁과 cysLT₂ 수용체가 있으며, 인간에서는 주로 cysLT₁ 수용체가 존재한다. cysLT₁ 수용체는 기관지 수축, 혈장 유출, 혈관 수축 및 호산구의 모집에 관여한다.
   LTs 길항제는 천식의 경우 기관지 수축의 방지, 기관지 이완 및 폐기능을 향상시키는 것으로 알려져 있지만 알레르기 비염의 경우 아직 연구가 적은 실정이다.
   이에 저자는 LTD₄ 수용체 길항제의 항 알레르기 비염 효과를 알아보기 위해 기니픽을 이용하여 감작군과 비감작군에서 LTD₄와 LTD₄ 길항제인 ONO-1078(Ono Pharmaceutical Co, Osaka, Japan) 투여 후 비강 용적 및 비점막의 미세구조 변화를 조사하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험동물로 건강한 체중 400 g 내외의 Female-Hartley계 기니픽 65마리를 사용하였다. 이 중 15마리는 대조군으로, 실험군으로 감작군 25마리와 비감작군 25마리로 나누어 실험하였다.

동물 감작
   25마리의 알레르기 모델을 만들기 위해 Ascaris suum allergenic extract를 dinitrophenyl(DNP)과 결합시킨 DNP-Ascaris(Ryukyu Med., Japan)를 사용하였다. 동물에 10 μg DNP-As 1 ml와 1 ml의 Al(OH)₃를 2주 간격으로 4회 복강 내 주사하여 감작을 시켰다. 복강내 주사 후 2주째 부터 비강내 감작을 위하여, 0.05% DNP-Ascaris 를 비강내에 분무기(Omron, NE-UIIB, Japan)를 사용하여 3분 동안 13 μl/sec의 속도로 하루에 한번씩, 5일 동안 주입하였으며, 입자의 크기는 약 5 μg였다. 최종 감작 10일 후에 실험에 이용하였다.⁶⁾

대조군 처치
   15마리의 대조군 가운데 5마리에서는 식염수 국소처치군으로 식염수 만을 주입하였으며, 나머지 10마리에서는 LTD₄ 처치군으로 10^-5 mol LTD₄ 2 μl를 양측 비강에 각각 분무기로 주입하였다.

실험군 처치
   50마리의 실험군 가운데 감작군 25마리는 용제(solvent)로서 carboxy methyl cellulose(CMC) 전신처치와 LTD₄ 국소처치군 5마리, 4-oxo-8-[p-(4-phenylbutyloxy) benzolamino]-2-(tetrazol-5-yl)-4H-l-benzopyren hemihydrate(ONO-1078)[BH]) 10 mg 전신처치 및 LTD₄ 국소처치군 10 마리, BH 30 mg 전신처치 및 LTD₄ 국소 처치군 10 마리로 나누었다.
   비감작군 25마리는 CMC 전신처치 및 LTD₄ 국소처치군 5마리, BH 10 mg 전신처치 및 LTD₄ 국소처치군 10마리, BH 30 mg 전신처치 및 LTD₄ 국소처치군 10마리로 나누어 실험하였다(Table 1).
   BH 및 CMC 전신처치군은 복강을 통해 주입한 후에, sodium pentobarbital을 체중 kg 당 30 mg씩 복강내 주입하여 마취를 시행한 후, 10^-5 mol LTD₄ 2 μl를 양측 비강에 각각 주입하여 국소처치를 시행하였다.⁷⁾

비강통기도검사
   비강용적은 G.J. Electronik(S Randerberg, Denmark)사의 기기를 사용하였다(Fig. 1). 생성된 음파는 마이크로폰을 지나 튜브를 통해 제작된 팁을 통해 비강에 전달되며, 반사된 음파는 마이크로폰을 통하여 기록, 증폭, 여과 및 디지털화 된다. 이 자료는 비강의 단면적과 팁으로부터 2 cm 후방까지의 용적을 계산한다. 팁은 2개의 Eppendorf tip을 사용하여 비강에 적합하도록 제작하였으며, 팁 주위의 공간과 비강의 빈 공간을 제거하기 위하여 300 mmHg의 압력으로 흡입하여, 팁이 비강에 맞도록 하였다(Fig. 2).⁸⁾ 처치 전과 처치 후 30분, 3시간, 6시간에 각각 3회씩 측정하였다. 처치 전 양측 비강에서 측정된 수치를 합하여 기준치로 정하고, 기준값에서 처치 후 30분, 3시간, 6시간 양측 비강에서 측정된 수치를 뺀 후, 기준치로 나누어 백분율로 계산하였다.

투과전자현미경검사
   실험에 사용된 기니픽을 주입 전, 주입 후 30분, 주입 후 3시간, 주입 후 6시간에 각 군을 단두하고 비중격 및 비갑개에서 조직절편을 채취하여 미세구조의 형태학적 변화를 관찰하였다. 정중 절개한 비강을 phosphate buffered saline(이하 PBS)로 잘 세척 후 점막을 채취하였다. 조직을 2.5% glutaldehyde-1.5% paraform-aldehyde액에 고정하고 탈회한 다음 조직을 1% osmium tetroxide로 다시 3시간 고정하고, 50%, 70%, 90%, 95%, 100%의 알콜로 탈수과정을 거친 후에 araldite 혼합액으로 포매하였다. 포매된 조직은 1 μm 두께의 절편을 만들어 toluidine blue로 염색하여 혈관과 주변 부위를 선택하여 LKB-V ultratome으로 60~70 nm의 투과현미경용 절편을 작성한 후 uranyl acetate와 lead citrate로 염색하여 투과전자현미경(HS-9, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 미세구조를 관찰하였다.

결     과

비강통기도 검사에 의한 비강용적변화
   대조군에서 식염수 처치군의 비강용적변화는 주입 30분 후 -4.4±2.2%, 3시간 후 2.6±9.9%, 6시간 후 0.9±16.0%로 변화가 없었으며, LTD₄ 국소처치군의 비강용적변화는 주입 후 30분에 -28.7±10.7%로 비강 용적의 급격한 감소를 보였으며, 3시간 후 -2.75±15.5%로 회복되었고, 6시간 후 -20.8±12.3%로 다시 용적이 감소했다(Table 2).
   비감작군에서 CMC 전신처치와 LTD₄ 국소처치 군의 비강용적변화는 주입 30분 후 -27.0±4.5%, 3시간 후 -3.9 ±5.9%, 6시간 후 -20.5±4.8%로 LTD₄ 단독 투여군과 비슷한 양상을 보였다. 10 mg과 30 mg BH와 LTD₄ 국소처치 군의 비강용적변화는 주입 후 30분에 -4.7±7.8% 와 -6.3±9.0%, 3시간 후 -1.5±2.7%와 3.5±8.7%, 6시간 후 -7.7±12.5%와 2.2±8.7%로 비강 용적의 큰 변화를 보이지 않았다(Table 3).
   감작군에서 CMC 전신처치와 LTD₄ 국소처치 군의 비강용적변화는 주입 30분 후 -26.7±3.5%, 3시간 후 0.3±5.72%, 6시간 후에 -26.5±4.52%로 이상성 현상과 비슷한 양상을 보였다. 그러나 10 mg과 30 mg BH와 LTD₄ 국소처치 군의 비강용적변화는 주입 후 30분에 -4.1±5.8%와 -3.5±4.9%, 3시간 후 1.9±4.9%와 -0.5±4.3%, 6시간 후 -6.9±11.8%와 -3.7±3.0%로 비강 용적의 큰 변화를 보이지 않았다(Table 4). 

투과전자현미경 소견
   대조군에서 LTD₄ 주입 30분 후 혈관벽의 수축이 일어났으며, 저전자밀도의 적혈구가 혈관내에 보여 혈관의 허혈과 무과립 세포를 관찰할 수가 있었으며, 혈관벽의 수축 및 호중구가 관찰되었다(Fig. 3). 주입 3시간 후 혈관벽의 형태는 잘 유지되었으며, 많은 중성구들이 관찰되었다(Fig. 4). 주입 6시간 후 호산구의 침윤이 혈관주위에서 관찰되었다(Fig. 5).
   비감작군에서 BH를 처치한 경우 혈관의 수축 및 호중구의 침윤 소견이 관찰되었으나, 호산구의 침윤은 관찰되지 않았다(Fig. 6).
   감작군에서 BH 처지한 군에서 주입 6시간 후 혈관 주위에 많은 호중구들의 침윤을 관찰할 수 있었으나, 호산구의 침윤은 관찰할 수 없었다(Fig. 7).

고     찰

   알레르기 비염은 IgE와 관련된 비점막의 염증반응으로 전 세계 인구의 20%를 차지한다.⁹⁾ 계절성과 통년성으로 분류되며, 화분(pollen)이 계절성에 관련되며, 집먼지 진드기, 동물 비듬과 곰팡이 등은 통년성 알레르기 비염과 관련이 있다. 또한 직업 혹은 음식과도 관련이 있다. 증상은 비소양감, 재채기, 수양성 비루와 비폐색을 나타내며, 인두, 안구, 귀 부위의 소양감, 결막염, 결막부종을 동반하기도 한다.
   항원이 IgE가 결합된 비만세포나 호염기구의 FcεR1 수용체에 결합하여 히스타민과 다른 매개체의 분비를 유도한다. IgE 수용체는 비만세포와 호염기구에 분포하며, 항원-IgE 복합체에 의해 활성화된 후 히스타민과 같은 이미 생성되어 있는 물질을 분비하는데, 이는 알레르기의 증상인 재채기, 가려움증, 비폐색을 유발하며, 평활근의 수축과 혈관 투과성을 증가시킨다.
   알레르기 반응은 조기와 후기 반응으로 나타나는데, 조기 반응은 보통 몇 분 내에서 1시간 내에 일어나며, 비만세포의 탈과립과 혈장이 유출된다. 조직검사에서 점막표면의 비만세포의 탈과립이, 히스타민, tryptase, PGD2과 LTs 등이 관찰된다. 히스타민은 조기 반응에 관여하는 주된 물질로 알려져 있다.
   후기에는 T-cell의 활성화, 부착물질의 생산과 호산구의 침윤이 동반된 만성 염증을 유발하는데, 혈장의 유출, 호산구의 용해와 독성물질 분비 및 조직의 손상 등을 나타낸다. 보통 항원 반응 후 2~4시간 뒤에 나타나며 24~48시간 후에 소실된다. 이 후기반응은 제 III형의 반응에 의한다고 생각한다. 조직검사상 유발검사 후 24시간 뒤에 Th2 세포의 증가를 관찰할 수 있다. 즉 Th2 세포의 증가와 활성화, 부착물질의 증가, 호산구의 침윤, 분비 및 활성 등이 나타나는데, 이는 부신피질호르몬을 사용하여 Th2 세포의 활성을 억제하여 후기 반응을 조절할 수 있음을 보여준다.
   LTs는 과거에 slow-reacting substance of anaphylaxis(SRS-A)의 성분으로 1940년 Kellaway와 Trethewie가 기니픽에서 히스타민 보다 강력하고 서서히 나타나는 평활근 수축 물질을 발견한데에서 비롯된다.¹⁰⁾ LTs는 arachidonic acid로부터 5-lipoxygenase에 의해 5-hydroxyeicosatetraenoic acid(5-HPETE)로 대사되고, 5-HPETE는 5-lipoxygenase에 의해 다시 LTA4로 대사되며, 이는 LTC₄ synthetase에 의해 LTC₄로 생성된다. LTC₄는 gamma glutamyl transpeptidase에 의해 LTD₄로 대사된다. LTC₄와 D₄는 혈관 투과성과 세포액의 유출을 증가시키고 조직의 부종을 일으킨다. 이러한 변화는 알레르기 비염에서 후기 반응에 관여한다고 알려져 있다.⁵⁾ LTs는 거의 모든 세포에서 염증반응에 관여하는 강한 매개체로 알려져 있다. Cys LTs(LTC₄, D₄, E₄)는 알레르기 비염 환자에서 특이 항원 흡입 후 비강 세척 액에서 많은 양이 검출된다.
   LTs는 호산구, 비만세포, 호염기구, 호중구 등에서 분비되는데, LTs은 후모세혈관의 투과성을 증가시키고 혈장의 유출과 부종을 유발하게 된다. 호산구, 비만세포, 호염기구는 주로 LTC₄와 관련되며, 호중구는 LTB₄와 관련이 있다. LTC₄는 비만세포 등에 의한 조기 반응에 관련이 있으며, LTD₄는 혈류의 증가 및 비폐색을 유발시키나, 히스타민에 의해 유발되는 가려움증, 재채기, 비루 등은 유발하지 않는다. 또한 정상인의 경우에 LTD₄ 투여시 비폐색을 유발시키나, 분비물은 증가되지 않았다. 또한 알레르기 비염환자는 정상 환자보다 LTD₄에 대한 민감도가 훨씬 증가되어 있는데, LTD₄가 알레르기 환자에서 비폐색을 유발시키는 중요한 물질이라는 것을 시사한다.⁵⁾ 히스타민은 신경말단에 작용을 하지만, LTD₄의 경우 혈관과 분비샘에 직접 작용함으로써 재채기나 가려움증을 유발하지 않고 비폐색을 일으키는 것으로 생각되며, LTC₄와 LTD₄는 히스타민보다 5000배 이상 강력한 물질로 알려져 있다.¹¹⁾ 조기 반응시에 히스타민, 키닌, PGD₂, LTs(C₄, D₄와 E₄) 그리고 트립신분해효소의 증가를 관찰하였으며, 이 반응은 비만세포가 깊이 관여한다.¹²⁾
   감작된 기니픽을 연구에 이용하기 위하여 여러 물질을 이용하여 왔지만, 사용한 물질에 따라 여러 특성을 보인다. Ascaris suum에서 추출한 물질을 항원으로 이용한 연구에서 이 모델이 적절함을 보고하였다. 본 연구는 이 결과를 토대로 알레르기 모델로 이용하였다.
   Hilberg 등¹³⁾은 비강의 용적 변화를 측정하기 의하여 전산화단층촬영과 비강통기도검사를 비교하였으며, CT에 비교하여 유의한 상관관계가 있음을 보고하였으며, 비강통기도검사가 빠르고 적절한 검사가 될 수 있다고 하였다. 또한 기니픽의 비강은 길이 2.3 cm, 직경 0.3 cm로 0.16 cm³의 면적을 보인며, T자 형태를 이루고 있으나, 비강 입구에서 후방 2 cm까지의 비강 만을 측정하여 약 30%정도 적게 측정된다고 한다.¹⁴⁾
   Ishii와 Wieslander¹⁵⁾는 기니픽을 이용한 모델에서 항원유발 후 10분에서 1시간까지 조기형 반응과 3~7시간에 나타나는 후기형 반응을 관찰하였다. 후기 반응기 동안에 기관지 근육의 수축으로 인하여 기관지의 내경이 감소함을 보였으며, 호중구가 풍부한 분비물을 관찰하였다. 이런 이유로 본 연구에 주입 30분 후, 3시간 후, 6시간 후에 변화를 측정하였다.
   LTD₄는 cysLT₁과 cysLT₂ 수용체와 반응하여 작용을 나타내게 된다.¹⁶⁾
   cysLT₁ 수용체는 기관지 수축, 혈장 유출, 혈관 수축, 호산구의 모집을 일으키며, cysLT₂ 수용체는 혈관에 작용하며 평활근의 수축을 일으킨다. 인간의 기관지에는 cysLT₁이 주로 분포하며, cysLT₂는 양의 기관지에 분포한다. 현재 5-LO(lipoxygenase) 차단제로 Zileuton(A-64077)과 cysLT₁ 수용체 길항제로 Zafirlukast(ICI/ZD-204,219), Montelukast(MK-0476)과 Pranlukast(ONO-1078, SB. 205,312)가 합성되어져 있다. 5-LO 차단제는 LTs 합성을 처음 단계에서 차단하는 작용을 하며, 이는 LTB₄와 cysLTs 모두를 차단하는 효과를 보인다. 현재 LTs 수용체 길항제와 5-LO 차단제에 관한 임상연구가 이루어져 있으며, Knappe 등¹⁷⁾은 Zileuton를 이용한 연구에서 비충혈, LTB₄ 및 5-HETE가 감소됨을 관찰하였으며, 재채기나 히스타민 분비에는 효과가 없음을 보고하였다. Flower 등¹⁸⁾은 류코트리엔 길항제인 L-649, 923을 이용한 실험에서 즉시형 반응에서는 효과가 없었다고 하였으며, Arlene 등¹⁹⁾은 LTD₄ 수용체 길항제 ICI 204,219를 185명의 비염 환자를 대상 연구에서 급성기의 알레르기 증상 중 비폐색이 완화되었다고 하였으며, Andrew 등²⁰⁾은 cysLTs1 길항제인 Montelukast를 이용하여 비루나 비폐색이 감소됨을 보고하였다.
   본 연구에서도 비강통기도검사를 통하여 비감작군에서 LTD₄ 주입 후 30분에 비강면적이 감소하였다가 3시간 후에 회복이 되면서, 다시 6시간 후에서 유효하게 비강 면적이 감소하는 이상성 현상이 나타났다. 또한 감작군에서 BH를 투여한 후에, 이상성현상이 나타나지 않음을 알수 있었다. 특히 후기에 나타나는 비강 저항의 증가는 관찰되지 않았다. 이는 LTs 수용체 길항제의 작용에 의한 LTD₄의 작용이 억제된 결과라 생각된다. 전자현미경 상에서 비감작군에서 LTD₄ 주입 30분 후에 일부 혈관의 허혈현상을 보였고, 세포 간격의 증가 및 호산구를 비롯한 염증 세포의 혈관밖 이동이 관찰되었고, 이러한 현상은 6시간 후에도 관찰되었다. 그러나 감작군에서 호중구는 혈관주위에 다수 존재하나, 호산구는 관찰되지 않았다. 이는 LTD₄가 알레르기 병리에서, 특히 후기 반응에 호산구의 조직내 이동 및 침윤을 억제하여 염증반응을 감소시키며, LTD₄ 수용체 길항제의 사용으로 후기 반응에 나타나는 증상인 비폐색을 완화할 수 있다고 생각된다.

결     론

   본 연구는 LTD₄의 작용 및 현재 천식 환자에서 효과가 있는 LTD₄ 수용체 길항제인 BH를 사용하여 효과를 알아보고자 하였다. 대조군에서 LTD₄ 주입 후에 이상성 현상이 나타났으며, 감작군에서 BH 투여 후에 비강통기검사를 통하여 이상성 현상이 차단됨을 관찰하였다. 또한 투과 전자현미경상 대조군에서 LTD₄ 주입 30분 후에 혈관벽의 수축이 일어났으며, 저전자밀도의 적혈구가 혈관내에 보여 혈관에 허혈과 무과립 세포를 관찰할 수가 있었으며, 또한 호산구 등을 포함한 염증 세포를 관찰할 수 있었으며, 주입 3시간 후 혈관벽의 형태는 잘 유지되었으며, 많은 호중구들이 관찰되었다. 6시간 후에는 호산구의 침윤이 혈관주위에서 관찰되었고, 또한 호산구들을 혈관내에서 관찰 할 수 있었다. BH를 투여하고 30분 후에는 혈관의 수축 및 호중구의 침윤 소견이 관찰되었으며, 6시간 후에 많은 호중구들의 침윤을 관찰할 수 있었으나, 호산구의 침윤은 관찰할 수 없었다. 이상의 결과로 LTs 수용체 길항제인 BH는 호산구 등의 침윤을 차단함으로서, 비폐색과 같은 후기반응에 나타나는 증상을 억제할 수 있다고 생각된다.

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