Effect of Platelet-Activating Factor and PAF-Antagonist on the Mucociliary Clearance of the Eustachian Tube in Guinea Pigs.

Rhee, Chung Ku

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(3); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(3): 273-278.

Effect of Platelet-Activating Factor and PAF-Antagonist on the Mucociliary Clearance of the Eustachian Tube in Guinea Pigs.

Chung Ku Rhee

Department of Otolaryngology, Dankook University College of Medicine, Cheonan, Korea. DKUHENT@unitel.co.kr

기니픽에서 이관기능에 대한 혈소판 활성인자와 혈소판 활성인자 길항제의 역할

이정구

단국대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: 혈소판 활성인자ㆍ혈소판 활성인자 길항제 점액섬모 청소기능ㆍ이관

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The purpose of this study was to test whether platelet activating factor (PAF) impairs the mucociliary clearance function of the eustachian tube (ET)in dose dependent manner and PAF-antagonist can prevent the impairment of mucociliary function of the ET induced by PAF.
RESULTS:
Coomassie Brilliant Blue (CBB) dye transport time (DTT) in normal guinea pigs was 69 seconds. The dye transport time after the applications of normal saline, PAF 1, and 2 ug/ml of PAF into the bullae were 66, 74, and 157 seconds, respectively. The time was over 15 minutes when 4, 8, and 16 ug/ml of PAF were applied. The DTT were 62 seconds when the animals were pretreated with PAF-antagonist (WEB 2170). There were significant delay in the DTTs after treatment with 2, 4, 8, and 16 ug/ml of PAF. Histopathological examination of ETs from groups with significant delay in DTTs showed intact cilia, mucus plugs, increased inflammatory cells, and exfoliation of cells.
CONCLUSION:
This study demonstrated that PAF impaired mucociliary clearance function of the eustachian tube in dosedependent manner. This impairment of mucociliary clearance function was prevented by pre-treatment with PAF-antagonist. The findings of this study suggest that PAF plays an important role in the pathogenesis of otitis media by impairing eustachian tube clearance function.

Keywords: PAFㆍPAF-antagonistㆍMucociliary clearance functionㆍEustachian tube

서론 바이러스성 또는 세균성 감염, 알레르기, 이관작용 이상 등에 의해 중이에 유출되는 염증매개체들은 삼출성 중이염의 병인에 중요한 역할을 한다. 최근의 연구들에 의하면 Prostaglandin과 Leukotriene1)과 같은 염증매개체와 더불어 혈소판 활성인자가 삼출성 중이염의 병인에 기여한다고 이해된다. 혈소판 활성인자는 많은 조직과 염증세포에 다양한 효과를 나타낸다.2) 1970년대 초반이후의 여러 연구에서 혈소판 활성인자는 급성염증과 알레르기에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 혈소판 활성인자는 사람의 호중구, 혈소판, 호산구, 대식세포, 비반세포, 그리고 혈관내피세포들로 부터 방출되는 염증매개물로 그 작용은 미세혈관 투과성 증가, 화학주성, 기관지 수축, 기관지 과민성의 증가, 기도점액분비의 증가, 저혈압의 유발, 쇽 그리고 사망을 포함한다.2) 혈소판 활성인자는 실험실적 연구에 의하면 섬모기능의 장애와 상피손상을 야기한다. 뿐만 아니라 혈소판 활성인자는 이관개구부의 미세순환의 감소와 이관개구압력의 증가에 의해 이관기능에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한 혈소판 활성인자에 의한 점액섬모계의 손상은 중이의 삼출액의 발생을 야기하며, 이는 또한 중이의 지속된 점액섬모기관과 이관의 기능장애에 의한 삼출액의 만성화를 유발한다.6) 사람의 삼출성 중이염의 표본에서 검출되는 혈소판 활성인자의 농도는 화농성 중이염에서 5.5 μg/ml, 점액성 중이염에서 7.6 μg/ml, 장액성 중이염에서 31.5 μg/ml이라고 보고되고 있다.7) 혈소판 활성인자-길항제(WEB-2170)는 혈소판 활성인자에 의해 야기된 삼출성중이염에 대항한 억제작용을 포함하여 여러 가지 혈소판 활성인자의 억제작용이 잘 알려져 있다. 이 연구의 목적은 혈소판 활성인자가 용량에 따라 비례적으로 이관의 점액섬모기능을 방해하는지 또한 혈소판 활성인자 길항제가 혈소판 활성인자에 의해 야기된 이관의 점액섬모기능의 장애를 막을 수 있는지를 연구하는 것이다.1) 재료 및 방법 실험동물 현미경 관찰에 의해 중이감염이 없음이 확인된 건강한 기니픽(300∼350g)의 78귀(39마리)가 사용되었다. 8귀에서 5.0% Coomassie brilliant blue 염료(CBB, Sigma chemical Co. St. Louis, Mo.)로써 평균 기본량 염료이동시간(DTT)이 측정되었다. 35마리(총 70귀)는 무작위로 다음과 같은 7군(각 군마다 5마리, 10귀)으로 배정되었다. (1) 양측 골포에 생리식염수를 주사한 생리 식염수 대조군. (2) 1μg/ml의 혈소판 활성인자(Sigma chemical Co. St. Louis, Mo.)를 주사한 1 μg군. (3) 2 μg/ml의 혈소판 활성인자를 주사한 2 μg군. (4) 4 μg/ml의 혈소판 활성인자를 주사한 4 μg군. (5) 8 μg/m의 혈소판 활성인자를 주사한 8 μg군. (6) 16 μg/ml의 혈소판 활성인자를 주사한 16 μg군. (7) 2 μg/ml의 혈소판 활성인자를 주사하고 혈소판 활성인자 길항제(WEB-2170, Boehringer Ingelheim, Germany)를 전처리한 후 혈소판 활성인자 길항제군. 염료이동의 측정 모든 실험은 Ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 Xylazine hydro-chloride(2 mg/kg)을 사용한 마취하에서 시행하였다. 실험 1(정상염료이동시간)；마취된 동물은 앙와위자세에서 마취를 강화하기 위해 1% Xylocain을 점적하였다. 이개구부 절개를 시행후 골포의 후부끝을 노출하였다. 골포에 23게이지 피하조직 바늘을 천자하여 남아있는 과량의 공기를 배출시켰다. 그 후 동물을 현미경하에서 구개를 노출시키기 위해 앙와위자세로 위치시킨 후 이관의 비인두개구부를 확인하기 위해 연구개를 절개하였다. 동물을 뒤집어 복와위 자세에서 0.15 ml의 CBB염료를 포에 주사한 후 염료가 이관의 비인두개구부에 나타나는 시간을 측정하였다. 실험 2(대조군과 혈소판 활성인자군, Table 1)；골포와 이관의 비인두 개구부는 실험1에서와 같은 방법으로 노출하였다. 대조군에서는 생리식염수 0.2 ml를 양측 골포에 주사하고 15분 후 5% CBB 0.15 ml를 같은 골포에 주사하였고, 염료가 이관의 비인강개구부에 보이기 시작하는 시간을 대조군의 이동시간에서와 같은 방법으로 측정하였다. 혈소판활성인자군들에서 각 동물의 양측골포에 생리식염수 0.2 ml에 1, 2, 4, 8, 16 μg/ml의 혈소판 활성인자를 주사하였다. 염료이동시간은 대조군에서와 같은 방법으로 5% CBB를 이용하여 측정하였다. 실험 3(혈소판 활성인자 길항제군)；생리식염수 0.2 ml에 혈소판 활성인자 2 μg/ml를 골포내 주사하기 2시간 전에 혈소판활성인자 길항제(WEB-2170), 10 mg/kg을 복강내 주사로 동물을 전처리하였다. 염료이동시간은 5% CBB를 사용하여 이전군에서와 같은 방법으로 측정하였다. 광학 현미경 관찰 각 군으로부터 얻어진 4개의 이관들을 조직학적 관찰을 위해 다음과 같은 방법으로 처리하였다. 이관들을 in situ 고정후, 골포에 2.5% Glutaraldehyde를 주사한 후 10% formalin으로 고정하였으며, 0.1 M/L Tris-buffered 식염수에서 10% Ethylenediaminetetra-aceticacid(EDTA)로 탈석회했으며, Graded series의 Ethanol washes에서 탈수된 후 파라핀에 담그어졌다. 15 μm의 두께로 절편을 잘랐으며 Hematoxyline과 eosin으로 염색하였다. 각 이관으로부터 동일한 영역을 관찰하기 위해서, 절편들은 고실부위와 비인강부위로부터 얻었다. 이관조직에서 섬모 및 이관내강 내의 점액플러그의 존재 여부, 상피박리의 정도, 염증의 정도가 측정되었다. 투과전자현미경관찰 2, 4 μg/ml 각 군으로부터 4개의 이관들을 투과전자 현미경 관찰을 위하여 골포에 2.5% Glutaraldehyde로 국소고정에 의해 준비하였다. 측두골로부터 이관을 절개한 후 조직을 완충용액(Phosphate-buffer, pH 7.2∼7.4)으로 세척하고 2.5% Paraformaldehyde-Glutaraldehyde로 고정하였으며, 1% osmic acid로 재고정 후 Graded series의 Ethanol washes를 통하여 탈수한 후, Epon-Araldite 용액에 담그었다. 표본을 절단 후 표준기술에 의해 염색하였으며, JEOL 100 CX-II 투사전자현미경으로 관찰하였다. 통계 자료의 분석은 95% 유의수준에서 one way ANOVA검사를 이용하여 실시하였다. 결과 CBB 염료 이동 본 연구 전에 저자는 점액섬모기능의 수행에 있어 실험물질의 양의 영향을 알아보고자 하였다. 0.2 ml 이상을 사용했을 때는 이관개구부로 즉각적으로 유출되는 것을 확인할 수 있었고 반면에 0.1 ml 이하의 염료는 염료이동의 독자적 기준인 15분 이후로 너무 지연되어 나타났다. 0.15 ml의 양에서는 재현성 있는 결과를 얻을 수 있었으며 따라서 본 연구에서 이러한 양을 사용하였다. 정상 기니픽의 중이로부터 비인두 개구부까지 이관을 통한 염료의 이동시간은 69±7초 였다. 생리식염수를 주사한 대조군에서는 중이로부터 이관 개구부까지 이동시간은 66±5초 였다. 혈소판활성인자 군에서의 이동시간은 1 μg 군에서 74±6초 였고, 2 μg 군에서 157±9초 였다. 4 μg 군에서 4귀에서 염료는 15분동안 나타나지 않았으며, 나머지 6귀에서 130초에서 9분까지의 시간이 소요되었다. 본 연구에서 저자는 염료가 15분 이내로 이관을 통과하지 않으면 더 이상의 시간이 경과하여도 염료는 이관을 통과할 수 없음을 알 수 있었다. 8 μg 실험군의 6귀에서는 15분동안 염료는 비인두 개구부에 나타나지 않았으며, 다른 4귀에서는 8에서 10 분이 소요되었다. 16 μg 군에서 10귀 모두에서 15분동안 염료를 볼 수 없었다. 혈소판 활성인자 길항제군에서는 염료를 62±5초에서 모두 볼 수 있었다(Table 2). 정상 염료통과시간과(Dye transport time：DTT) 생리식염수 대조군, 1 μg 군, 혈소판 활성인자 길항제군의 DTT간의 통계적 유의성의 차이는 없었다. 그러나 생리식염수 대조군과 2, 4, 8, 16 μg군간의 차이는 유의성이 있었다. 이관의 조직학적 변화 이관의 광학현미경 소견은 생리식염수 대조군, 1 μg 군, 혈소판 활성인자 길항제군(Fig. 1A, B and C)에서 최소 양의 점액플러그를 가진 깨끗한 이관내강, 최소 염증세포침윤, 최소 세포탈락의 소견을 보였다. 점액플러그의 양, 염증세포수와 세포탈락의 정도는 2, 4, 8, 16 μg군에서 보다 높았다(Fig. 2A, B, C and D). 일반적으로 점액플러그의 양과 염증세포의 침윤과 세포탈락의 정도는 Fig. 3에서와 같이 DTT가 지연된 군에서 보다 높았다. 투과전자현미경소견：2, 4 μg 군에서의 이관의 섬모세포의 형태학적 통합성은 잘 유지되어 있었다(Fig. 3). 고찰 Bakalrtz 등8)은 친칠라 이관의 중이로부터 비인두 개구부까지 염료의 이동시간 및 이동율을 측정한 바 있다. 실험동물로써 기니픽을 사용하여 저자들은 친칠라의 염료이동율과 같은 정상치를 얻었다. 광학현미경 연구에서 2 μg군에서 16 μg군까지 증가된 세포탈락을 보였지만 실험군의 이관 상피세포에서는 대부분 정상섬모를 관찰할 수 있었다. 본 연구에서 섬모운동의 감소는 2 μg군에서 16 μg군까지 혈소판 활성인자 용량에 따라 비례적인 감소를 보였다. 2 μg군에서 16 μg군까지 DTT는 혈소판 활성인자용량에 따라 비례적인 지연을 보였다. 2 μg군에서 DTT는 157초였고, 4 μg에서는 130초에서 9분까지 지연되었으며, 8 μg군에서 8분에서 10분으로 지연되었으며, 16 μg군에서 15분동안 염료는 통과하지 않았다. 염료가 통과하지 않은 이관의 수도 4 μg군에서 4, 8 μg군에서 6, 16 μg군에서 10으로써 혈소판 활성인자 용량에 따라 비례적으로 증가 되었다. 생리식염수군, 1 μg 혈소판 활성인자군, 혈소판 활성인자 길항제군에서 보다 2 μg군에서 16 μg군까지 보다 많은 점액 플러그를 발견할 수 있었던 결과는 혈소판 활성인자가 이관강내의 점액분비를 증가시키며 이관을 통한 염료의 지연을 야기시켜 비롯된 것이다. 생리식염수군, 1 μg과 혈소판 활성인자 길항제군에서는 최소한의 세포탈락 정도와 점액플러그의 양을 보였으며, 이관내강의 점액섬모기능은 정상범위내로 유지되는 소견을 보였다. 저자의 연구와 유사한 연구는 Lin9)10)등에 의하여 행해졌는데 그는 친칠라의 중이상피세포로부터 혈소판 활성인자용량에 따라 점액당단백질의 분비가 비례적으로 증가함을 보고하였다. 그는 또한 같은 연구에서, 혈소판 활성인자길항제와 합성억제재가 혈소판 활성인자에 의하여 자극된 점액분비를 저해한다는 결과도 얻었다. 혈소판 활성인자 노출에 의한 상피세포의 탈락은 사람의 부비동점막에서 관찰된 바 있다.11) 본 연구의 2 μg, 4 μg 혈소판 활성인자군에서 투과전자현미경상 이관의 섬모세포의 잘 유지된 형태학적 통합성을 보였는데 이러한 결과는 DTT의 지연이 섬모세포의 장해에 의해서가 아니라, 이관의 억제된 점액섬모기능에서 비롯됨을 의미한다. 이관의 점액섬모기능은 동물뿐 아니라 사람에서도 중이의 방어기전에 중요한 역할을 담당하고 있는데 이러한 점액섬모수송에 의해 중이의 조직파편과 삼출액이 이관을 통해 비인두로 배출된다.12)이러한 점액섬모기능의 장애는 중이의 삼출액의 발생을 유발하며, 이는 중이와 이관에서 점액섬모기구의 지속된 기능장애를 일으킴으로써 삼출성중이염의 만성화에 기여할 것이다.6) 그러므로 본 연구의 결과는 중이강 내에 염증이 형성됨과 아울러 분비되는 혈소판활성인자가 중이로부터 이관 내로의 점액섬모기능을 장애를 초래하여 삼출성중이염의 발생과 지속에 기여한다는 추론을 가능하게 한다. 저자들은 골포가 단지 10분동안만 혈소판 활성인자에 노출되었을 때 이관을 통한 염료이동시간의 어떤 지연도 관찰하지 못했다. 염료이동의 지연은 골포가 여러농도의 혈소판 활성인자에 15분동안 노출된 후 관찰되었다. 이러한 결과는 이관의 점막과 섬모가 2 μg/ml 또는 높은 농도의 혈소판 활성인자에 반응하기 위해서는 최소 15분이 필요하다는 것을 의미한다. 저자는 이전의 연구에서, 골포에 주입한 1 μg/ml의 혈소판 활성인자가 36시간에 삼출성중이염을 유발시켰고, 반면에 8 μg와 16 μg/ml의 혈소판 활성인자는 주입후 1시간 안에 중이삼출액을 형성함을 보고한 바 있다.1) 본 연구에서는 고농도의 혈소판 활성인자에 이관이 노출되었을 때, 짧은 시간 안에 점액섬모수송기능이 소실되고 삼출성중이염이 발생하였다. 이러한 결과는 이전의 연구1)에서 높은 혈소판 활성인자농도(8 μg/ml, 16 μg/ml)하에서 삼출성중이염이 발생되는 데 있어 저농도(1 μg/ml)의 혈소판 활성인자군에서보다 짧은 시간이 소요되었던 것에 대한 적절한 결과가 될 것이다. 혈소판 활성인자 길항제(WEB-2170)는 저자들의 이전 연구1)에서 혈소판 활성인자에 의해 유발된 삼출성중이염의 발생을 방지시켰다. 이러한 이전의 결과와 마찬가지로, 혈소판 활성인자 길항제로 전처리된 동물에서, 혈소판 활성인자에 의해 유발된 DTT의 지연은 일어나지 않았다. 그러므로 본 연구는 혈소판 활성인자 길항제는 혈소판 활성인자에 의하여 유발된 이관의 점액섬모기능 장애의 예방을 통하여 혈소판 활성인자에 의해 유발된 삼출성중이염의 발생을 예방할 수 있다는 사실을 보여주고 있다. 결론 본 연구를 통해 저자는 혈소판 활성인자가 기피닉에서 그 용량에 따라 비례적으로 이관의 점액섬모청소기능의 장애를 일으킴을 알 수 있었다. 이러한 점액섬모수숭기능의 장애는 혈소판 활성인자 길항제의 전처리에 의해서 예방될 수 있었다. 이러한 본 연구의 결과는 혈소판 활성인자가 이관청소기능의 장애를 통하여 삼출성중이염의 병인에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.
REFERENCES
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