서     론

   비용은 이비인후과 영역에서 자주 접할 수 있는 질환임에도 불구하고 그 원인이 명확히 밝혀지지는 않았다. 또한 적절한 동물 모델이 없어서 비용의 발생 기전 및 치료법에 대한 연구에 한계가 있었다. Tos 등¹⁾이 중이염 발생에 관한 실험에서 동물모델 가능성을 제시한 이래, Norlander 등²⁾에 의하여 상피 파열설이 정립되었다. 상피 파열설은 상피파열 후 지속적 염증 상태가 유지되면 정상적 치유 과정과 달리 상피-기질층간의 상호작용에 의하여 고유층 탈출(prolapse of lamina propria), 상피의 기질내 유입(epithelial ingrowth)이 일어나고,²⁾ 기질내 유입된 상피세포 내에 미세강형성(microcavity formation) 및 분화가 일어나며 이는 비용형성에 가장 중요한 요인이라고 하였다.³⁾
   스테로이드제는 현재까지 알려진 약제 중 비용의 치료에 가장 효과적인 약제로 국소 및 전신 투여한 스테로이드는 비폐색 증상을 감소시키며, 비용의 크기를 감소시킬 뿐 아니라 수술 후 재발을 방지하는 것으로 알려져 있으며⁴⁾ 손상된 상처의 회복과정에서 혈관재생을 억제하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾
   이와는 반대로 스테로이드 수용체 차단제인 RU 486은 스테로이드 수용체와 높은 친화성을 갖고 있어 내인성 스테로이드의 작용을 효과적으로 억제할 수 있다.⁶⁾ 따라서 RU 486을 사용하여 염증반응에 의하여 유도될 것으로 생각되는 내인성 스테로이드의 작용을 차단한다면 비용 발생에 있어서 스테로이드의 역할을 이해하는데 많은 도움이 될 수 있다고 생각한다.
   본 연구는 토끼의 상악동 점막에 기계적 손상만으로 비용의 발생을 유도하는 과정에서 스테로이드 및 스테로이드 수용체 차단제를 생체 분해성인 polylactic acid(PLA)를 이용하여 국소 투여함으로서 이들 약제가 초기 비용 형성 과정에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 또한 스테로이드 및 스테로이드 수용체 차단제가 초기 비용 형성 과정에서 혈관 재생에 미치는 영향을 알아보기 위해서 혈관의 평활근에 친화력이 있는 α-actin으로 면역조직화학적 염색을 하여 혈관 재생 및 신생 혈관의 분포와 비용과의 관계를 규명함으로서 비용에서 스테로이드제의 치료 기전을 이해하고자 하였다.

대상 및 방법

재  료

   실험동물은 체중 2.5~3.5 kg의 New Zealand white rabbit 20마리를 암수의 구분 없이 사용하였다. 실험 기간 동안 일정한 사육 환경에서 먹이를 충분히 주어 사육하였고, 실험시 상악동에 저류액이 있거나 비정상 점막 소견을 보이는 동물은 본 실험에서 제외하였고, 일측 상악동에만 실험하였다.
   실험군은 점막 손상후 mometasone을 투여한 군(M군, n＝8), RU 486을 투여한 군(R군, n＝8), 국소 약물 전달체인 PLA만 투여한 군(C군, n＝4)으로 구분하여 실험하였다.
   실험에 사용한 스테로이드는 최근에 개발된 전신 흡수율이 0.1% 미만인 mometasone furoate(Schering-Plough Research Institute, New Jersey, U.S.A.)를 사용하였고, 스테로이드 수용체 차단제로는 스테로이드 수용체와 아주 높은 친화성이 있어서 매우 강력한 스테로이드 억제 효과를 갖고 있으며 스테로이드 수용체의 80%를 차단하는 것으로 알려져 있는 RU 486(Russel, UCLAF, Paris, France)을 사용하였다.⁶⁾ 이들 약제를 상악동내 국소 투여하는 방법으로 polylactic acid를 약물 전달체로 사용하였으며, 본 실험에서는 비교적 체내에서 약 30일 정도로 빠르게 분해되며 안정성이 잘 알려진, poly-(D,L-coglycolid) 50：50(Boeringer Ingelheim, Mainz, Germany)을 사용하였다.⁷⁾ 약제는 mometasone 12 mg 또는 RU 486 24 mg을 각각 PLA 50 mg과 혼합하여 chloroform 50 cc를 첨가한 다음 magnetic stirrer로 혼합한 후 teflon cast에 24시간 상온에서 건조하여 film 상태로 만든 다음 용매를 완전히 제거하기 위하여 1 mbar 정도의 저음압 건조기에서 일주일간 건조시켜 사용하였다.

비용의 유도
   Ketamine(50 mg/kg)으로 전신 마취 후 비배부의 털을 깎고 베타딘 용액과 알코올로 소독한 후 골막을 포함한 피부를 조심스럽게 박리하였다. 상악동의 전벽을 노출시킨 후 전기드릴을 사용하여 약 4×8 mm의 구멍을 만들어 상악동의 병변 유무를 확인한 다음, 수술시 얻은 뼈 조각과 histoacryl^®(Braun Melsungen AG, Germany)로 상악동의 자연공을 막은 후 전상악동의 내측벽 점막을 소식자를 사용하여 골막의 손상이 없도록 주의하며 직경 6 mm 정도의 원형으로 기계적 손상을 준 다음 이미 만들어진 1.5×1.5 cm 크기(각각 mometasone 3.8 mg, RU 486 7.6 mg이 함유됨)의 필름형태의 약제를 말아서 상악동에 넣었다. 1주와 3주 후에 M군과 R군은 기간별로 각각 4마리씩, C군은 각각 2마리씩 희생하여 관찰하였다.

육안적 관찰

   수술현미경하에서 조심스럽게 저류액을 제거한 후, 손상을 주었던 점막 부위를 관찰하여 Norlander 등³⁾의 정의에 따라 정상 점막에 비하여 융기된 붉은색 조직이 관찰되면 비용과 유사한 구조물로 간주하였다.

조직학적 관찰

   통상적 파라핀 포매 과정을 거친 조직을 6 μm 두께의 연속 절편을 만들어 hematoxylin & eosin(H-E)으로 염색하여, 광학현미경으로 관찰하였다. 병변은 Norlander등³⁾과 같은 방법으로 상피파열설에 따라 상피파열, 고유층 탈출, 상피의 기질내 유입, 미세강 형성 등의 단계별로 분류하여 관찰하였다.

면역조직화학적 염색 및 판정

   Forsgren 등⁸⁾의 방법대로 혈관 및 신생 혈관의 분포를 관찰하기 위하여 혈관의 평활근에 친화력이 있는 α-actin을 사용하였다. 일차 항체로는 쥐 단클론항체(DAKO A/S, Grostrup, Denmark)를 Tris 완충액(Tris buffer saline)으로 100배 희석하여 사용하여, Avidin-biotin complex(ABC) Kit(DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용한 labelled avidin biotin 기법으로 면역 염색하였다. 파라핀 블록을 6 μm 두께로 자른 후 조직이 부착된 슬라이드를 탈파라핀화 시킨 뒤 증류수에 함수시켰다. Microwave oven에서 조직슬라이드가 마르지 않게 주의하며 2분간 처리한 다음, 조직내의 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3%의 과산화수소에 20분간 처리 후 증류수로 세척시켰다. 조직내의 비특이적 항원 항체 반응을 억제하기 위하여 정상 염소 혈청에 30분간 처리한 후 4°C에서 12시간 일차 항체와 반응시켰다. Tris 완충액로 씻어낸 뒤 biotin과 결합된 염소의 anti-mouse 혈청을 이차 항체로 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 Tris 완충액으로 세척한 다음 streptavidin-peroxide를 실온에서 반응시킨 후 Tris 완충액으로 세척하여 발색제인 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC)에 반응시켜 hematoxylin으로 대조염색 후 wet mounting하여 광학현미경으로 관찰하였다.
   면역조직화학적 염색의 발현 정도는 비용의 변연부와 중심부로 나누어 강한 발현(＋＋＋), 중간정도의 발현(＋＋), 약한 발현(＋)으로 판정하였다.

결     과

육안적 관찰
   1주 M군과 R군 모두 3예에서 비용과 유사한 구조물이 관찰되었고, 3주 M군은 2예에서, 3주 R군에서는 전례에서 비용과 유사한 구조물이 관찰되었으며 특히 R군은 M군에 비해서 비용 유사 구조물의 크기가 좀 더 큰 양상을 보였다. 또한 M군은 시간이 경과할수록 비용 유사 구조물의 크기가 감소하는 반면에 R군에서는 기간이 경과할수록 더욱 성숙한 비용으로 발달되면서 크기가 커지는 양상을 보였다(Table 1).

조직학적 관찰
   1주 M군에서 상피파열이 1예, 고유층 탈출이 3예에서 관찰 되었으며 이 중 1예에서 상피의 기질내 유입이 관찰 되었다(Fig. 1A). 3주 M군에는 1주 M군과 같이 3예에서 고유층 탈출을 보였고 이 중 1예에서 상피의 기질내 유입이 관찰 되었으며 정상 상피 조직으로 회복된 경우도 1예가 있었다. 반면에 기간에 관계없이 R군에서는 좀더 진행된 초기 비용 형성 단계를 관찰 할 수 있었다. 1주 R군 전례에서 고유층 탈출이 관찰되었으며 이중 2예에서 상피의 기질내 유입이, 1예에서 미세강 형성이 관찰되었다. 3주군에서는 2예에서 상피의 기질내 유입이, 2예에서는 미세강 형성이 관찰되었고, 미세강 형성은 1주에 비하여 좀 더 발달되어 있었다. 이로보아 R군은 M군에 비해서 기간이 경과 할수록 좀 더 성숙된 비용으로 발전하였으나 M군은 기간이 경과할수록 더 이상 비용으로 진행되지 않고 회복되는 양상을 보였다(Table 2).

면역조직화학적 관찰

   비용의 중심부에서는 C군 및 R군은 중증도의 발현을 보였으나 M군은 약한 발현을 보였다. 그러나 비용의 변연부에서는 R군은 강한 발현을, C군은 중증도의 발현을 보였다. R군에서 미세강 형성이 관찰된 군이 상피의 기질내 유입만 관찰된 경우보다 비용의 변연부에서 많은 혈관의 분포를 보였다. 또한 비용의 변연부 뿐 아니라 중심부까지 혈관이 분포해 있는 양상을 보였고 특히 미세강 주위에 많은 신생혈관이 관찰되었다. 미세강의 크기가 크고 미세강내의 세포들이 입방형을 보이는 부위는 미세강의 크기가 작고 편평한 미세강내 세포를 보이는 부위보다 더 많은 신생 혈관의 분포를 나타내었다. 비용의 변연부에서, 특히 상피의 기질내 유입이 보이는 부위에서도 비교적 많은 미세 혈관이 관찰되었는데 정상 점막 쪽에는 비교적 큰 혈관이 분포되어 있었으며, 이보다 작은 신생 혈관이 비용의 변연부를 따라 비용의 상부와 하부로 자라나는 양상을 보였다. 특히 상피의 기질내 유입이 관찰된 M군 2예에서는 R군에서 상피의 기질내 유입을 보이는 군과 차이를 보여, 비용의 변연부를 따라 하부와 상부로 자라나는 작은 신생 혈관이 M군에서는 R군에 비해서 현저히 적었다. 또한 비용의 상층부까지 도달하는 신생 혈관을 M군에서는 관찰 할 수 없었다(Fig. 2 and Table 3).

고     찰

   비용은 높은 유병율을 보이는 질환임에도 불구하고 그 병인에 대해서는 많은 논란이 있다. 1855년 Billoth가 선종설(adenoma theory)을 주장한 이래 Hopmann의 섬유종설(fibroma theory), Woakes의 괴사성 사골염설(necrotizing ethmoiditis theory), Harjek의 점막 삼출설(mucosal exudate theory), Jenkins의 폐쇄설(blockade theory), Krajina의 선증식설(glandular hyperplasia theory) 등의 많은 가설이 발표되었으나 비용의 병인을 명확히 설명하는 학설은 없었다.⁹⁾ 또한 비용은 적절한 동물 모델이 없기 때문에 기초 연구에 많은 어려움이 있었으나 최근에는 Tos 등¹⁾과 Norlander 등²⁾³⁾ 주장한 상피파열설이 널리 받아들여지고 있다. Norlander 등²⁾³⁾ 의하면 상피파열이 된 경우 대부분은 정상 점막으로 치유가 되지만, 지속적인 감염 및 염증상태가 유지되면 정상 치유 과정과 달리, 주변 결합조직세포의 증식이 일어나며, 상피-기질층간의 상호작용에 의하여 기질내로 상피의 유입이 일어나다. 이때 유입된 상피세포에서 혈관재생 과정 및 세포내 소공(intracelluar vacuoles)이 형성되며 이 소공(vacuoles)들이 융합을 하여 내관(lumen)을 형성하고 내부에 성숙된 내피(matured endothelium)를 형성한다. 이후 세포질내 내관(intracytoplasmic lumina)은 미세융모(microvilli)로 내피화하면서 외피성숙과정(epithelial maturation process)을 거치게 된다. 점차 미세강(microcavity)는 서로 융합하여 커지면서 비강 점막으로부터 분리되어 완전한 비용이 형성된다고 하였다.³⁾
   비용의 가장 효과적인 치료제인 스테로이드의 국소 또는 전신적인 사용은 비용의 크기를 줄이며 새로운 비용 형성을 억제할 뿐 아니라 수술 후 재발을 방지하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 이와는 반대로 합성 스테로이드인 RU 486은 프로제스테론 수용체를 효과적으로 차단하여 처음에는 피임제로 개발되었으나 과량 사용하는 경우 스테로이드 수용체를 효과적으로 차단하여 강력한 항스테로이드의 작용을 나타낸다. 이는 스테로이드 분자와 세포내 수용체가 결합하는 과정에서 RU 486이 덱사메타손의 약 3배 강력한 결합 능력으로 약 80%의 스테로이드 수용체와 결합하여 스테로이드와의 결합을 방해하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 또한 수용체와 더욱 안정된 복합체를 이루기 때문에 보다 지속적이며 강력한 차단제로서의 역할을 하게 될 뿐 아니라 핵내의 glucocorticoid response element의 작용도 억제하여 내인성 스테로이드의 작용을 효과적으로 억제한다.¹⁰⁾ 본 연구에서는 스테로이드는 최근에 개발된 전신 흡수율이 0.1% 미만으로 전신에 영향이 적은 mometasone furoate를 사용하였고, 스테로이드 수용체 차단제로는 내인성 스테로이드의 작용을 최소화하기 위해서 RU 486을 사용하였다. 이들 약제를 일정 기간 동안, 안전하게, 상악동내 투여하기 위해서, 약물 전달체로 잘 알려진 polylactic acid를 사용하였다. Polylactic acid는 인체에 무해하며 조성비를 조절하면 분해 속도를 조절할 수 있을 뿐 아니라 염증 반응이 거의 없고 중요 장기에 축적되지 않는다는 장점이 있으며,¹¹⁾ Min 등¹²⁾은 토끼에서 실험적 부비동염을 만든 후 항생제를 함유한 폴리머를 사용하여 효과가 있음을 보고하였다. 본 연구에서도 Min 등과 같은 방법으로 필름 형태로 만들어 사용하였다.
   스테로이드가 손상된 점막의 재생에 미치는 영향에 대해서, Hosemann 등¹³⁾은 토끼의 상악동 점막에서 손상된 상피점막의 재상피화는 수상 후 수 시간내에 시작되며, 이때 상처 부위 변연부에서 미분화한 상피세포가 손상된 부위로 이동이 일어나고 이 미분화한 세포들은 재분화하여 정상적인 상피 세포가 되는데, 이 과정에서 스테로이드는 초기에는 점막 결손의 재생을 지연시키지만, 후기에는 섬유화를 감소시켜 손상 부위의 재생을 촉진한다고 하였다. Stierna¹⁴⁾는 토끼에서 실험적으로 유도된 비용에서 미리 투여한 스테로이드는 특히 상피의 이동과 미세강 형성을 억제하고, 동시에 비강내 국소 병원균을 억제하여 비용 형성을 억제한다고 하였다. Norlander 등¹⁵⁾에 의하면 비용 형성시 일어나는 세포학적인 변화는 상피 손상 후에 일어난 상처 치유 과정과 여러 유사성이 있으며 주로 비용의 형성은 손상 후 보통 1~2주 내에 일어난다 하였다. 점막의 손상의 치유는 초기 염증 반응인 혈관 투과성의 증가, 세포질내 삼출액 유출, 혈액응고 인자의 활성화, 혈소판 응집, 과립구의 침투 등이 일어나는데, 스테로이드는 이러한 초기 염증 반응에 영향을 주며, 손상 후 상피의 이동과 혈관형성에 영향을 준다 하였다. 본 연구에서는 스테로이드 투여군의 경우 시간이 경과함에 따라 정상 상피로 변화하는 양상을 나타내었다. 그러나 스테로이드 수용체 차단군의 경우는 시간이 경과함에 따라 상피의 기질내 유입 및 미세강 형성 등의 비정상적인 치유과정을 보여 좀더 진행된 초기 비용 형성 단계를 나타내었고, 이는 Stierna의 연구와 유사한 결과이다. 이로 보아 스테로이드는 정상 치유과정을 촉진하는 것으로 생각되며 스테로이드 수용체 차단제는 내인성 스테로이드를 차단하여 비용 형성을 촉진하는 것으로 생각된다.
   본 연구에서 초기 비용 형성과정의 혈관재생 및 신생 혈관의 분포를 관찰하기 위하여 혈관의 평활근에 친화성을 갖는 α-actin을 일차 항체로 사용하여 면역조직학적 염색으로 부위별 혈관의 분포를 관찰하였다. 스테로이드군은 비용의 변연부에서 특히 신생 혈관의 발달이 미약하였고 또한 상부 및 하부로 자라나는 신생 혈관이 스테로이드 수용체차단제군이나 대조군에 비해서 적었다. 반면에 스테로이드 수용체 차단제군의 변연부에서는 수 많은 신생 혈관들의 증식이 관찰되었고 또한 미세강을 형성한 경우 많은 신생 혈관들이 미세강 주위와 비용의 변연부에서 관찰되었으며 신생 혈관의 분포가 많은 비용일수록 좀 더 발달된 경향을 보였다. 일반적으로 신생 혈관이 기존의 혈관에서 증식하려면, 혈관에서 분비된 효소가 기저막을 분해한 후에 혈관내피세포가 이동하여 관상(tubular)의 구조를 형성한 다음 서로 융합하며 혈관망을 형성한 후 상처 부위에 혈류를 유지한다. 혈류가 없는 모세혈관은 24시간 이내에 퇴화하는 것으로 알려져 있다. 신생 혈관 생성을 억제하는 요인로는 protamin, platelet factor-4, interferons, steroid 등이 알려져 있는데¹⁶⁾ 특히 스테로이드는 혈관내피세포의 이동과, 염증 조직에서 신생 혈관 발달을 억제하는 것으로 알려져 있다.5)
   이로보아 스테로이드는 비용 변연부에서 신생 혈관의 발달을 억제하며 이는 비용 형성을 억제하는데 중요한 요인으로 작용 할 것으로 생각된다. 특히 변연부의 신생 혈관의 억제가 미세강 형성과 융합을 억제하고 비용의 변연부에서의 분리를 방해하여 완전한 비용 형성을 억제하는 것으로 생각된다.

결     론

   총 20마리 토끼 상악동 점막에 기계적 손상을 준 후 스테로이드(mometasone) 및 스테로이드 수용체 차단제(RU 486)를 국소 투여하여 이들 약제가 초기 비용 형성 과정에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
   스테로이드 투여군은 시간이 경과 할수록 비용의 크기가 감소하며 스테로이드 수용체 차단군에서는 기간이 경과 할수록 진행되어 더욱 성숙한 비용으로 발달하는 양상을 보였다. 또한 조직학적으로 관찰한 비용 형성 및 발달 단계에서도 스테로이드 투여군은 비용 발생 단계의 지연 및 퇴화를 보였으나 스테로이드 수용체 차단군에서는 촉진하는 소견을 보였다.
   초기 비용 형성 단계에서 스테로이드는 비용의 변연부에서 혈관 및 신생 혈관의 감소를 시켰으며 정상 치유 과정을 촉진하여 초기 비용 형성을 억제 하였다. 반면에 스테로이드 수용체 차단제는 상피의 기질내 유입 및 미세강 형성 등의 비정상적인 치유과정을 보였고 비용 형성을 촉진하였다. 이는 비용의 변연부의 신생 혈관의 억제는 스테로이드가 비용형성을 억제하는 또 다른 기전으로 생각된다. 이로 보아 비용의 초기 형성 과정에 있어서 내인성 스테로이드를 포함한 스테로이드가 중요한 역할을 할 것으로 생각되어 향후 실험적 연구 및 치료에 내인성 스테로이드에 의한 효과를 감안하는 것이 필요한 것으로 생각된다.

1. Tos M, Mogensen C. Pathogenesis of nasal polyps. Rhinology 1977;15:87-95.

2. Norlander T, Bronnegard M, Stierna P. The relationship of nasal polyps, infection, and inflammation. Am J Rhinol 1999;13:349-55.

3. Norlander T, Westin KM, Fukami M, Stierna P, Carlsoo B. Experimentally induced polyps in the sinus mucosa: A structural analysis of the initial stages. Laryngoscope 1996;106:196-203.

4. Holmberg K, Karlsson G. Nasal polyps; Surgery or pharmacological intervention? Eur Resp Rev 1994;4:260-65.

5. Ingber DE, Madri JA, Folkman J. A possible mechanism for inhibition of angiogenesis by angiostatic steroids: Induction of capillary basement membrane dissolution. Endocrinol 1986;119:1768-75.

6. Gagne D, Pons M, Philibert D. RU 38486: A potent antiglucocorticoid in vitro and in vivo. J Steroid Biochem 1985;23:247-51.

7. Ogawa Y, Yamamoto M, Okada H, Yashiki T, Shimamoto T. Anew technique to efficiently entrap leuprolide acetate into microcapsules of polylactic acid or copoly (lactic/glycolic) acid. Chem Pharm Bull 1988;36:1095-103.

8. Forsgren K, Otori N, Stierna P, Kumlien J. Microvasculature, blood flow and vasoreactivity in rabbit sinus mucosa after surgery. Laryngoscope 1999;109:562-8.

9. Tos M. The pathogenic theories on formation of nasal polyps. Am J Rhinol 1990;4:45-9.

10. Busso N, Collart M, Vassalli JD, Belin D. Antagonist effect of RU 486 on transcription of glucocorticoid-regulated genes. Exp Cell Res 1987;173:425-30.

11. Conti B, Pavanetto F, Genta I. Use of polylactic acid for the preparation of microparticulate drug delivery systems. J Microencapsulation 1992;9:153-66.

12. Min YG, Kim YK, Jeong SY. Application of polylactic acid polymer in the treatment of acute maxillary sinusitis in rabbits. Acta Otolaryngol (Stockh) 1995;115:548-52.

13. Hosemann W, Wigand ME, Gode U, Langer F, Dunker I. Normal wound healing of the paranasal sinuses, clinical and experimental investigations. Eur Arch Otorhinolaryngol 1991;248:390-4.

14. Stierna P. Nasal polys: Relationship to infection and inflamation. Allergy and Asthma Proc 1996;17:251-7.

15. Norlander T, Kwon SH, Heniksson G, Westrin KM, Sandstedt K, Stierna P. The effects of systemic pretreatment with betamethasone on the bacterial flora, inflammatory response and polyp formation in experimentally infected rabbit maxillary sinus mucosa. Laryngoscope 1998;108:411-7.

16. Diaz-Flores L, Glutlerrez R, Varela H. Angiogenesis: An update. Histol Histopath 1994;9:807-43.