Expression of the p53 Protein and Detection of HPV by ISH in Sinonasal Inverted Papilloma.

Na, Han Jo; Kim, Kyeong Il; Lee, Do Yong; Choi, Bong Nam; Doh, Nam Yong; Lee, Mi Sook; Suh, Chae Hong

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(3); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(3): 342-349.

Expression of the p53 Protein and Detection of HPV by ISH in Sinonasal Inverted Papilloma.

Han Jo Na, Kyeong Il Kim, Do Yong Lee, Bong Nam Choi, Nam Yong Doh, Mi Sook Lee, Chae Hong Suh

¹Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chosun University, Kwang-Ju, Korea.
²Department of Pathology, College of Medicine, Chosun University, Kwang-Ju, Korea.

반전성유두종에서 p53유전자 단백의 표현양상과 <i>In Situ</i> Hybridization에 의한 인형유두종바이러스 검출

나한조¹ · 김경일¹ · 이도용¹ · 최봉남¹ · 도남용¹ · 이미숙² · 서재홍²

조선대학교 의과대학 이비인후과학교실1;병리학교실2;

주제어: p53ㆍHPVㆍISHㆍ반전성유두종.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The p53 protein is a 53 kD phosphoprotein. It is also one of the early recognition markers of malignancy and can be used to predict the aggressive behaviors of tumor. The human papilloma virus (HPV) is a species-specific, epitheliotrophic, double-stranded DNA virus. The purpose of this study was to evaluate the expression rate of p53, and to investigate whether a correlation exists between the rate of recurrence and the severity of lesion. We also investigated whether p53 expression rate and HPV affect recurrence and carcinogenesis of inverted papilloma.
MATERIALS AND METHODS:
Twenty-two cases of the inverted papilloma and 6 cases of squamous cell carcinoma arising in the inverted papilloma were used for the study. We used immunohistochemical staining for p53 and performed the molecular study of HPV DNA with in situ hybridization (ISH) on the paraffin embedded materials.
RESULTS:
1) The overall expression rate of p53 was 39% (11/28). A significant correlation was observed between p53 protein accumulation and the severity of the lesion (p=0.0015). 2) Seven of 11 patients who tested positive for p53 showed recurrence, whereas two of the 12 patients who tested negative for p53 showed recurrence. There was a correlation between the rates of p53 expression and recurrence (p=0.029). 3) The HPV was detected in four cases (13%) of inverted papilloma. There was no statistical significance between HPV and the rate of recurrence(p=0.147).
CONCLUSION:
The results demonstate that p53 mutations and HPV may play a role in the oncogenesis of inverted papilloma.

Keywords: p53ㆍHPVㆍISHㆍInverted papilloma

서론 비강 및 부비동에서 드물게 발생하는 반전성 유두종은 상피가 기질속으로 반전하는 특징을 갖는 양성종양이나 재발이 잦고, 주위조직을 파괴하는 경향과 아울러 5~15%정도는 악성종양과 동반하거나 전환될 수 있어 지속적이고 세밀한 추적관찰이 필요한 질환이다. 본질환의 원인으로는 바이러스, 알레르기, 만성부비동염, 비용, 흡연 및 환경적 유해인자 등과의 연관성이 언급되어 왔지만, 아직까지 확실한 원인 및 발생기전은 잘 알려져 있지않다. 그러나 최근에는 바이러스에 의한 가능성, 특히 인형 유두종 바이러스(human papilloma virus)에 의한 감염설이 보고되고 있다. 또한 분자생물학의 발전에 따라 활발하게 연구되고 있는 여러 종양유전자 중 하나가 p53 유전자이며, 이 유전자의 산물인 p53단백은 53 kD의 분자량을 갖는 핵인단백질로서 자연형은 암억제유전자로 작용하지만 변이형은 암억제유전자의 기능을 소실하여 암유전자로서 작용한다고 알려져 있고 현재 여러암에서 p53과 임상적 경과 혹은 예후와의 관련성에 관한 많은 연구가 이루어지고 있으며 악성변화 및 암종의 파괴적 양태를 예측할 수 있는 초기 식별인자로서 역할이 기대되고 있다. 이에 저자들은 반전성유두종에서 p53발현률과 병변의 악성도 및 재발율과의 상관관계를 찾아보고, HPV의 감염률 및 아형에 따른 악성화의 관련성 등을 통하여 p53유전자 표현과 HPV검출이 반전성유두종의 암화기전에 대해 미치는 영향을 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법 실험 대상 실험대상으로는 1987년 1월부터 1996년 12월까지 조선대학교병원 이비인후과에 내원한 환자중 병리조직학적 검사로 확진된 반전성유두종 22례(Fig. 1A)와 악성변화를 동반한 6례(Fig. 2A)를 포함한 총 28례를 대상으로 하였다. 성비는 남자 23명, 여자 5명이었고 나이는 24세에서 82세로 평균연령은 55세였다. 방법 조직학적검색 병리조직학 검사상 반전성 유두종으로 확진된 28례의 파라핀 블록을 4 μm두께로 연속절편을 만들어 이중 한절편을 H-E염색을 하여, 이미 제작되어 있는 H-E염색표본과 같이 재검토하여 양성형 반전성유두종, 이형성을 동반한 경우, 그리고 악성변화를 동반한 경우 3군으로 분류하였다. 면역조직화학적 염색 4 μm 두께로 절편한 조직을 Probe-on plus slide(Charge & precleaned slides, Fisher scientic Co.)에 부착시켜 하룻밤동안 정온기에 충분히 건조한 후 탈파라핀과 함수과정을 거친후 실험에 이용하였다. 음성대조군으로는 1차항체 대신 생리적 식염수를 사용하였고 양성대조군은 결직장암 조직을 이용하였다. p53단백의 항원성을 유지하기 위해 통상의 과정을 통해 탈파라핀과 함수과정을 거친후 microwave oven을 이용한 과정을 거쳤다. 전자렌지를 이용한 과정은 10 mM, pH 6.0 citrate buffer(stock solutions；A：0.1 M solution of citrate, B：0.1 M solution of sodium citrate, Working solution 9 ml of A＋41 ml of B, diluted to a total of 500 ml)가 담긴 유리상자에 함수과정을 거친 유리 슬라이드를 넣고, 이를 전자렌지에 넣어 750 w로 조절하여 매 5분씩 4회 반복 가열하였다. 그후 슬라이드는 유리상자에 담근 채 20분 가량 실온에서 방치시켜 식혔고, 인산완충액으로 세척한 후 사용하였다. 그리고 조직절편위로 p53단백에 대한 항체를 점적시켜 실온에서 40분간 반응시킨후 통상적인 peroxidase labeled Avidin-Biotin(LAB-SA)법으로 염색하였다. 발색제인 AEC(3-amino-9-ethylcarbaxole)에 10분간 염색한 후 Mayer’s hematoxylin으로 대조염색한 후 crystal mount로 봉입하여 현미경으로 검경하였다. p53 단백에 대한 염색의 판정은 세포핵안에 적갈색 과립이 있는 세포를 기준으로 하여 종양핵이 집단적으로 적갈색으로 염색된 예를 양성으로, 수개의 종양핵만 염색되거나 혹은 염색되지 않으면 음성으로 판정하였다. In Situ Hybridization법을 이용한 인형 유두종 바이러스 DNA의 검출 파라핀에 포매된 조직을 4 μm두께로 절편하여 Probe-on-plus슬라이드에 붙인후 충분히 건조시켰다. Probe on plus 슬라이드에 부착된 조직을 100℃에서 Autodewaxer(Amerco)에 2분씩 4번 반복하여 탈파라핀 시킨후, 실온에서 Autoalcohol로 110℃에서 ribonuclease에 1분간 노출시킨 후 핵산을 잘 노출시켜 염색효과를 높이기 위해 단백 분해효소인 pepsin으로 100℃ 에서 3분간 부치시킨 후 다시 formamide에 2분 동안 부치시켰다. Nick translated probe인 인형유두종 바이러스 6/11, 16/18, 31/33/35 형 probe를 hybridization cocktail(Amersco)로 희석하여 110℃에서 1분동안 부치시킨후 110℃에서 95℃, 85℃까지 단계적인 농도에 반응시키고 온도변화의 중간 중간에 실온에서의 냉각기간을 두면서 Hybridization을 시행 하였다. Hybridization이후에 비특이적 결합을 한 probe를 제거할 목적으로 2×SCC에 수세한후 Biotin에 강한 결합력을 가지는 strep-Avidin에 alkaline phosphatase를 45℃에서 6분간 작용시켜 tissue target DNA와 Hybridization이 된 Biotinylated된 probe와 결합하도록 하였다. stable fast TR/NPT chromogen을 45℃에서 20분 작용시켜 strep-alkaline phosphatase와 반응하여 진홍빛으로 나타나는 경우를 양성반응으로 판정하였으며 hematoxyline으로 대조 염색을 시행하였다. 음성 대조군으로는 비강내의 폴립을 이용하여 반전성 유두종의 어떤핵에도 염색이 되지 않음을 확인하였으며 양성 대조군으로는 중합효소연쇄 반응으로 인형유두종 바이러스의 존재가 확인된 자궁경부 편평상피암의 조직을 이용하여 양성 반응이 검출되는 것을 확인하였다. 통계학적 검증 통계학적 검증은 Chi-square 검사 및 Fisher exact test를 시행하였으며 유의수준은 p<0.05로 하였다. 결과 p53 단백의 발현률과 병변의 악성도와의 연관성 p53의 양성반응은 세포의 핵이 진한 갈색으로 염색되는 양상(Fig. 1B)으로 나타났고 악성변화를 동반한 부위에서 특이적으로 강하게 염색되어 주위의 양성부위와는 확연한 차이를 보였다. p53의 전체적인 발현률은 28례중 11례, 39%였으며 이중 이형성이 동반된 반전성유두종 3례중 2례, 편평세포암이 동반된 경우는 6례중 5례가 강한 양성반응을 보여(Fig. 2B) 병변의 악성도가 증가할수록 강하게 발현되어 p53발현율과 악성도와는 통계적으로 매우 유의한 상관관계가 있었다(p＝0.0015)(Table1). p53 단백의 발현과 재발과의 연관성 추적기간이 1년 미만인 5례를 제외한 23명중, p53이 발현된 11명중 7명이 재발하였고 p53음성인 12명중 2명에서 재발하여 p53발현과 병변의 재발간에 통계적으로 유의한 상관관계를 보였다(p＝0.029)(Table 2). HPV의 검출 ISH를 이용한 HPV의 검출 결과 반전성유두종 4례(14%)에서만 검출되었으며(Table 1), 감염된 핵내에서 붉게 염색되어 관찰되었다(Fig. 3). 양성반응을 보인 4례 모두 6/11형 이었고 16/18형과 31/33/35형은 한 례도 검출되지 않았다. HPV와 재발과의 연관성 추적조사기간이 1년이상인 23례중, HPV가 검출된 4례중 3례에서 재발하였으나 HPV가 검출되지 않은 19례는 6례에서 재발을 보여 HPV가 검출된 예에서 검출되지 않은 예보다 재발율이 높았으나 통계적의의가 없었다(p＝0.147)(Table 3). p53단백과 HPV의 동시 발현률 및 악성화 가능성 p53과 HPV가 동시 발현된 경우가 1례 있었으나 이환자의 병력검토 결과 약 2년의 추적기간동안의 재발 및 악성변화의 징후는 아직 없었다. 고찰 암의 발생은 여러 단계를 거쳐서 일어나는 것으로 추정되고 있으며 이런 과정 중에서 정상세포가 암으로 진행되는데는 다양한 유전적인 변화가 관계되며, 변화된 유전자의 축적으로 인하여 암이 발생된다고 생각하는 것이 요즘 추세이다. 이러한 유전자의 변화를 측정하는 방법중에서 면역조직화학적 방법에 의한 검출법이 소개되어 이방법으로 이미 보관되어 있는 암조직을 이용한 후향적 연구가 가능해졌다. 현재까지 알려진 여러 암유전자중 가장 흔히 발견되는 p53유전자의 산물인 p53단백은 암 유전자중 세포의 핵에 존재하는 인단백으로 세포의 주기를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 자연형은 암억제유전자로 작용하지만 변이형은 암억제유전자의 기능을 소실하여 암유전자로서 작용한다고 알려져 있다.1)2) 현재 여러암에서 p53과 임상적 경과 혹은 예후와의 관련성에 관한 많은 연구가 이루어지고 있으며 악성변화 및 암종의 파괴적 양태를 예측할 수 있는 초기 식별인자로서 역할이 기대되고 있다.1) Dolcetti등3)은 후두편평상피암에서 p53의 발현은 임상병기나 조직학적 분화도 및 생물학적 성상과는 관련이 없으며 p53의 발현이 침윤성 암종의 초기변화라고 하였고, Field등4)은 말기 두경부 편평상피암의 약 16%에서 p53에 양성으로 발현되었는데 p53에 발현을 보이지 않은 환자들보다 예후가 나빴으며, 암말기에 종양의 생물학적 성상에 p53유전자가 중요한 역할을 한다고 주장하였다. 이처럼 p53단백 발현율과 여러 예후인자들과의 상관성을 조사한 연구가 다수 보고되고 있으나 그 결과는 아직 논란의 여지가 많으며 비강 및 부비동 종양에서의 연구 역시 미미한 실정이다. 저자들이 시행한 연구결과 반전성유두종에서 p53단백의 전반적인 표현률은 28례중 11례로 39%였고 병변의 악성도가 증가할수록 강하게 발현되어 p53단백 발현률과 악성도와는 통계적으로 유의한 상관관계가 있음을 알 수 있었고, 또한 p53발현군과 p53음성인 군과의 재발율의 비교에서 p53양성인 군에서 통계적으로 유의하게 높아 p53발현이 편평세포암으로의 변환에 한 역할을 하리라 생각하며, 아울러 예후 추정인자 및 전구암에서 암으로 변화될 위험성을 예측할 수 있는 생물학적 표지자(biomarker)로서 이용 가능성을 시사하였다. 그러나 재발률의 경우 좀 더 많은 증례를 통하여 재발에 관여하는 여러 가지 요인, 즉 병변의 원발부위, 수술방법, 추적조사기간, 병변의 침범범위 및 부위, 악성화 정도 등이 고려된 보다 객관적인 비교방법의 적용이 필요하리라 생각된다. 반전성유두종의 원인 및 유발인자들 중 하나로서 바이러스에 의한 가능성, 특히 HPV에 의한 감염설이 최근 보고되고 있다. 1983년 Syrjanen이 반전성 유두종의 원인인자로 HPV를 처음 기술한 이래 분자생물학의 발전에 따라 많은 연구논문에서 HPV의 역할이 보고되고 있다.5-8)11) 다중심성(multicentricity), 주위 상피조직의 이형성화(epithelial metaplasia), 공포화(koilocytosis), 재발경향과 종양화는 본종양이 바이러스가 원인인자임을 간접적으로 시사한다.5)8) 그러나 HPV 검출률은 0~89% 정도로 매우 다양하여 이 바이러스의 관련성에 논란의 여지가 많은 것도 사실이다. HPV는 세포성 기원의 저 분자량 히스톤으로 되어 있는 약 8 kb의 이중가닥 DNA 바이러스로, 5×10 6 daltons의 분자량을 가지고 있으며, 유전자 구조의 차이에 따라 최근까지 약 100여종의 아형이 밝혀져 있고, 상피친화성 바이러스(epitheliotropic virus)로 동물이나 인체의 상피조직에서 양성 혹은 악성종양의 원인인자로 작용하고 있다.9) 인체에서는 자궁경부나 항문생식기계의 악성종양이 HPV감염에 의하여 발생한다는 것이 정설로 되 있으며, 두경부 영역에서도 상부 호흡기계 종양의 발생에 대한 역할이 연구되어져 왔다.9)10) 두경부종양에 관여하는 HPV아형은 종양의 악성도에 따라 3군으로 나눌 수 있는데, HPV type 16, 18은 심한 세포이형성증, 전구암 병소, 악성 상피변형을 예측하는 지표로 사용되므로 고위험군(high risk group)으로 분류하며, HPV 31, 33, 35은 상피내암종에서 고도의 세포 이형성을 나타내므로 중등도 위험군(intermediate risk group)으로, HPV type 6, 11은 저급 상피내암종이나 양성유두종과 연관이 있으므로 저위험군(low risk group)으로 분류한다.12) Syrjanen등13)은 비강 및 부비강의 반전성유두종과 편평상피암에서 HPV typing을 시행하여 반전성유두종에서는 HPV 6 및 11, 편평상피암에서는 HPV 16이 양성임을 보고하였다. 조직내의 virus존재를 확인하는 방법으로는 광학현미경이나 전자현미경을 이용한 세포내 봉입체나 viron의 확인, 항체를 이용한 면역조직화학염색법, southern blot hybridization, in situ hybridization(ISH), polymerase chain reation(PCR) 등의 방법이 있다. 이중 ISH법은 1969년 Gall등에 의하여 처음 소개된 이후 분자생물학의 발전과 함께 virus감염진단에 있어서 특이성이 가장 높은 검사법으로 알려져 있다.14) ISH법의 장점은 조직을 분쇄하지 않고 그대로 이용하므로 세포나 조직의 형태가 잘 보존된 상태에서 양성 반응을 나타내므로 감염된 세포의 조직내 위치 및 세포내 감염부위도 확인할 수 있어 특이성이 높으며, 소식자(probe)와 target DNA나 RNA간의 결합이므로 훨씬 선택적이고 강한 결합을 이루며, 파라핀 절편을 이용할 수 있기 때문에 아주 적은 검체물로 검사가 가능하고 후향적 검사가 가능하다는 장점이 있다.15) 그러나 각세포에 50~200개 이상의 virus genome이 있어야 검출이 가능하기 때문에 southern blot hybridization이나 PCR에 비해서 민감도가 떨어지며 시간이 많이 걸린다는 단점이 있다.16) 이에 반해 PCR은 보관된 파라핀 조직을 이용할 수 있고 연속적인 DNA복제로 염기서열을 수백만배 중폭시킴으로써 HPV형을 알수 있고 민감도가 가장 높은 검사방법으로 알려져 있다. 그러나 Southern blot나 PCR등은 일반 조직으로부터 DNA만을 추출하여 검사하기 때문에 바이러스 DNA의 존재여부는 알 수 있으나 바이러스에 감염된 세포가 주로 어느 부위에 위치하는지 밝힐 수가 없다. 또한 오염에 의한 위양성의 가능성이 항상 문제가 된다. 이처럼 각각의 방법에는 장단점이 있으므로 최근의 연구는 두가지 방법을 이용하여 검출율을 비교하곤 하는데5)6)8) 비강 및 부비동의 반전성 유두종에 있어서 민감도는 거의 비슷하다고 한다. 그러나 반전성유두종의 HPV의 검출율이 보고자에 따라 차이가 심한데 여기에는 여러 가지 요인이 관여하리라 생각된다. 즉 검출방법과 기술상의 문제가 많이 관여하고, 인형유두종 바이러스에 감염된 세포 내에서의 바이러스 DNA의 복제정도나, 검체의 보존상태, 지역 및 인종간의 차이, 사용되는 probe나 primer의 종류에 따라서 검출율에 있어서 심한 차이를 보인다고 한다.8) ISH를 이용한 본연구 결과 HPV의 검출은 반전성유두종 4례(14%)에서만 검출되었으며 모두 6/11형 이었고 16/18형과 31/33/35형은 한례도 검출되지 않았다. 따라서 HPV가 반전성 유두종의 원인 인자로서의 한역할을 할 것으로 생각되나, 악성 전환에 중요한 역할을 할 것으로 생각되는 16/18형과 31/33/35형은 한례도 검출되지 않아 악성 상피변형을 예측하는 지표로서의 가능성을 입증하는 데는 실패하였다. 반전성유두종의 재발 및 악성화 가능성을 예측할 수 있는 유용한 조직학적 지표(criteria)는 아직 없으며 이에 관해서는 논란의 여지가 많은 실정이다. 그러나 최근 Beck17)18)는 HPV양성인 15명의 환자에서 13명이 술후 재발한 반면 HPV음성인 10명의 환자는 재발이 없었다고 보고하여 HPV가 반전성유두종 환자의 재발 및 예후에 크게 관여하리라고 시사하였다. 그러나 Furuta등7)은 HPV 존재여부와 병변의 국소침윤, 전이등 예후와 상관관계가 없었다고 보고하여 견해를 달리하였다. 본실험에서는 HPV가 검출된 4례중 3례에서 재발하였으나 HPV가 검출되지 않은 19례중 6례에서 재발을 보여 HPV가 검출된 예에서 HPV가 검출되지 않은 예보다 재발율이 높았으나 검출례가 적어 통계학적 의의는 없었다. 한편 여러암에서 빈번히 발견되는 p53 유전자의 변화가 HPV와 밀접한 관계를 이루고 있다는 최근 보고가 있다. 그이유로서 자궁 경부암 발생에 관여하는 것으로 알려진 HPV E6, E7 단백은 세포의 형질변환을 일으키는 주된 산물로 인식되고 있으며, E6, E7 단백과 다른 DNA 종양 바이러스의 형질전환 단백과의 유사성이 보고되고 있다. Adenovirus E1b, SV40LT와 HPV E6 단백과 결합하여 p53 유전자 단백을 불활성화 시키며, 이 형질전환 단백들이 p53 단백에 결합하는 부위가 구조적으로 서로 유사하다는 사실도 밝혀졌다.19) 이런 사실은 HPV가 암발생시 E6, E7 단백이 세포성장을 조절하는 p53단백의 불활성화를 야기시킴으로서 발암과정에 관여할 수 있다는 것을 시사한다. 본실험결과에서도 p53에 발현을 보이면서 HPV가 검출된 예가 한례 있었다. 따라서 반전성 유두종에서 HPV의 종양유발기전에 대한 연구와 소위 고위험성 HPV인 HPV16/18형이 악성 암종을 유발하는 기전과 아울러 발암과정에 있어서 p53유전자 변이와 HPV와의 관련성에 대한 보다 심도있는 연구가 필요하리라 생각된다. 결론 악성변화를 동반한 경우를 포함한 28례의 반전성 유두종조직에서 p53유전자 단백의 면역조직화학적 염색과 ISH를 이용한 인형유두종바이러스의 검출을 통하여 다음과 같은 실험 결과를 얻었다. 1) p53단백의 전반적인 발현률은 39%였고 병변의 악성도가 증가할수록 강하게 발현되어 p53발현률과 악성도와는 통계적으로 유의한 상관관계가 있었다(p＝0.0015). 2) 추적기간이 1년 미만인 5례를 제외한 23례중 p53이 발현된 11명중 7명이 재발하였고 p53음성인 12명중 2명에서 재발하여 p53발현과 병변의 재발간에도 역시 통계적으로 유의한 상관관계를 보였다(p＝0.029). 3) ISH를 이용한 HPV검출은 반전성유두종 4례(14%)에서만 검출되었고 검출된 4례 모두 type 6/11이었으며 HPV가 검출된 예에서 HPV가 검출되지 않은 예보다 재발율이 높았으나 통계적의의는 없었다(p＝0.147). 결론적으로 HPV와 p53이 반전성유두종 원인의 일부로서 작용하며, HPV와 악성화와의 관련성은 증명하지 못하였으나, p53의 경우에 있어서는 악성도나 재발과 밀접한 상관관계를 보이므로 반전성유두종의 예후지표로서 유용하리라 생각되나 좀더 많은 증례의 연구가 필요하리라 생각된다.
REFERENCES
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