교신저자：차창일, 130-702 서울 동대문구 회기동 1번지  경희대학교 의과대학 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 958-8483 · 전송：(02) 958-8470 · E-mail：khuent@khmc.or.kr

서     론

   진주종성 중이염은 과증식하는 각질화 된 편평상피세포로 만성적인 염증을 동반하고 있으며, 진주종성 중이염에서의 만성적이고 반복되는 감염은 전신적인 항생제나 국소 항생제에 저항이 강하고 잘 치료가 되지 않는 것이 특징이다. 이러한 진주종성 중이염에서의 감염은 일반적으로 만성적인 이루 등의 증상을 야기하고¹⁾ 골흡수 및 골파괴를 증가시켜 치명적인 합병증까지 발생할 수 있어²⁾ 진주종성 중이염에 있어 병원균과 숙주인 인체와의 상호 관계 및 작용은 매우 중요하다고 생각되나 아직까지 이에 대한 연구는 부족한 실정이다.
   인체에서는 정상 피부조직이나 진주종 모두에서 주위에 많은 세균이 존재하고 이들과 최초로 접촉하는 상피세포는 계속적인 항원의 자극 속에서 체내의 항상성을 유지하기 위해 자극에 대한 반응을 조절하는 선천 면역체계(innate immunity)를 유지한다.³⁾⁴⁾ 병원균에 대한 숙주의 반응은 선천 면역체계에서 항원제시세포(antigen presenting cell；APC)에 의해 발현되는 여러 cytokine과 chemokine, 또는 보조작용분자(costimulatory signal) 등을 통해 적응 면역체계로 중개된다.⁵⁾ 최근 지다당류(lipopolysaccharide；LPS) 등을 포함하는 형태-인지수용체(pattern-recognition receptor)가 알려진 후 병원성-연관 분자 형태(pathogen-associated molecule pattern：PAMPs)가 선천 면역에 중요한 역할을 함이 알려졌다.⁶⁾⁷⁾
   Toll-like receptor(TLR)는 포유류와 초파리의 생체방어체제에서 공통적으로 발견된 막단백질 family로 선천면역체계에서 병원성-연관 분자형태의 인지에 관여하며 선천면역과 적응면역에 활발하게 관여한다. TLR이 리간드를 인식하면 신호전달이 시작되는데 신호전달은 Toll/interleukin-1 receptor(TIR)도메인을 통한 Nuclear factor-kappaB(NF-κB)의 활성화로 수용체 자극시에 interleukin-1 receptor(IL-1R) 신호와 유사하게 MyD88, IL-1R associated kinase(IRAK), NF-κB-inducing kinase(NIK), IκB kinase(IKK), NF-κB의 경로를 통해 활성화 되는 공통점이 있다.⁸⁾ NF-κB의 활성화에 의해 친염증성 cytokine을 발현하고 한편으로는 CD80, CD86과 같은 면역반응의 보조물질의 세포발현을 조절하여 적응면역에 관여한다. TLR family는 현재까지 10종류의 아형이 알려져 있는데 이중 세균성 병원체를 인지하는 대표적인 것으로 TLR 2와 4가 있고 이들에 대한 연구가 활발하다. TLR 2는 주로 그람양성균의 세포벽 성분인 peptidoglican, lipoteicoic acid, lipoprotein 등의 수용체로 알려져 있고 그람음성균의 내독소인 지다당류에 대해서도 반응하는 광범위한 수용체이나⁸⁾ TLR 4는 특징적으로 그람음성균의 지다당류, heat shock protein 등의 수용체 역할을 한다고 알려져 있다.⁹⁾
   본 연구에서는 세균성 병원체를 인지하는 대표적인 수용체인 TLR 2와 4의 중이 진주종에서의 발현을 알아보고자 실시간 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(Real time RT-PCR)법과 면역조직화학염색을 이용하여 중이 진주종에서 TLR 2와 4의 mRNA 및 단백질의 발현을 알아보고 정량 분석을 통해 정상대조군인 외이도 피부와 비교해 보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   실험군으로는 2003년 11월부터 2004년 5월까지 본원 에서 진주종성 중이염으로 수술 받은 환자 17예(17귀)로부터 수술시 채취한 진주종 조직을 사용하였고 선천성 진주종이 의심되는 경우는 제외하였다. 대조군으로 8예의 정상 외이도 피부조직을 골부에서 채취하여 사용하였다. 채취한 조직편은 채취 후 즉시 액화질소로 냉동하였으며 멸균된 eppendorf tube에 넣은 후 실험시까지 영하 70℃에 보관하였다.

실시간 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(Real time RT-PCR)법

Total RNA의 추출
   채취한 조직에 Trizol 500.0 μl를 첨가한 후 syringe를 이용하여 세포를 균질화 시키고 15~30℃에서 5분간 방치한 후 chloroform 100.0 μl를 첨가하여 부드럽게 inverted mix하여 잘 섞이게 하였다. 4℃에서 12000 g으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 채취하였다. 채취한 상층액을 새 tube에 옮기고 동량의 isopropanol과 혼합하여 실온에서 10분간 침전시킨 후 12000 g으로 10분간 원심분리하여 RNA pellet을 얻었다. 여기에 75% ethanol 500.0 μl를 넣어 7500 g으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 상온에서 방치하여 RNA pellet을 완전히 건조시킨 후 DECP(Diethylpyrocarbonate) 용액으로 RNA pellet을 녹였다. 녹인 RNA는 분광광도계인 DU 530(Beckman instrument, CA, USA)를 이용하여 260 nm에서 순도 및 정량을 하였다.

cDNA의 합성
   추출한 RNA를 대상으로 first standard cDNA synthesis kit(Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Germany)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사중합효소반응(RT-PCR)의 조건은 10х buffer 2.0 μl, 25 mM MgCl 4.0 μl, dNTP 2.0 μl, oligo-dT primer 2.0 μl, RNasin 1.0 μl, AMV reverse transcriptase 0.8 μl의 혼합액에 RNA 1.0 μg을 넣은 후 멸균증류수를 첨가하여 총 20 μl가 되게 하였다. 이상을 Thermal Cycler(9700, Biosystem, USA)로 25℃에서 10분, 42℃에서 60분, 99℃에서 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

정량적 중합효소연쇄반응
   합성된 cDNA를 Light Cycler System(Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Germany)을 이용하여 FastStart PCR(Roche Molecular Biochemical, Mannheim, Germany)시약으로 정량적 중합효소연쇄반응을 시행하였다. 10хbuffer 2.0 μl, 2.5 mM dNTP 1.6 μl, primer(10 pmol/μl) 1.0 μl, amplitaq 0.4 μl, DNA double-strand specific SYBR Green I dye가 포함된 혼합액에 cDNA 1.0 μg을 넣은 후 멸균증류수를 첨가하여 총 20 μl가 되게 하여 증폭하였다.
   증폭과정은 TLR 2의 경우 95℃ 15초, 53℃ 5초, 72℃ 12초 TLR 4의 경우는 95℃ 15초, 55℃ 5초, 72℃ 15초였고 대조유전자(internal control)로 사용한 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 경우는 95℃ 15초, 63℃ 5초, 72℃ 12초였으며 각각 증폭과정을 40회 시행하였고 중합반응시 형광신호를 컴퓨터를 통해 측정하였다.
   사용한 primer의 염기서열 및 증폭산물의 크기는 Table 1과 같다.
   유전자의 발현정도는 중합효소 연쇄반응 주기 40회를 cut-off로 하여 측정하였고 최종 PCR산물은 전기영동을 시행하여 결과를 확인하였다.

중합효소 연쇄반응의 상대적 정량화
   증폭된 중합효소연쇄반응산물의 정량화를 위하여 분광광도계를 이용하여 농도를 측정한 GAPDH를 함께 증폭하여 threshold cycle 수를 얻었고 이를 기준으로 표준검량선을 작성한 후 이 검량선의 수식에 의하여 각 산물을 상대적으로 정량화하였다. 즉, 증폭되는 DNA의 양이 많을수록 형광이 처음 검출되는 연쇄반응 주기의 시점이 빨라진다는 것을 이용하여 threshold cycle의 수를 구한 후 TLR 2와 4의 농도를 정량된 GAPDH의 농도로 나누어 TLR 2와 4의 농도를 구하였다.

통계 및 분석
   진주종조직과 정상 외이도 피부조직에서의 TLR 2와 4의 mRNA의 농도의 차이를 비교하였고 Mann-Whitney's U 법을 이용하여 통계처리하였다. 유의수준은 p<0.05로 하였다.

면역조직화학염색
   각각의 조직을 영하 70℃로 보관한 후 신선한 검체를 포매액(embedding medium)에 넣은 상태에서 10 μm 두께로 냉동 절편을 제작하였다. 이 절편을 30분간 상온에서 말린 후 phosphate buffered saline(이하 PBS)으로 세척하고 포르말린 용액에서 15분간 처리하였다. 그 후 다시 PBS로 세척 한 후 상온에서 30분간 말렸다. 조직절편은 먼저 조직 내에 존재하는 내재성 페록시다제(endogenous peroxidase)를 비활성화 시키기 위해 PBS에 희석한 1% H2O2에서 15분간 반응시킨 후 10분씩 3회 PBS로 세척하였다.
   일차항체로는 rabbit polyclonal anti-TLR 2와 4 antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A)를 0.05% bovine serum albumin, 1.5% goat serum 및 0.3% Triton X-100이 들어 있는 용액으로 1：50으로 희석한 후 조직과 90분 동안 4℃에서 진탕하면서 반응시켰다. 1차 항체용액과의 반응이 끝나면 조직을 PBS로 10분씩 3번 세척한 후 EnVision system의 biotinylated anti-IgG(DAKO, Copenhagen, Denmark)을 0.3% Triton X-100이 들어있는 용액으로 1：200으로 희석한 2차 항원용액과 60분 동안 실온에서 반응시키고 이후 PBS로 3차례 세척하였다.
   이후 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma, St. Louis, Mo., U.S.A)를 0.05 M Tris 완충액으로 0.02%로 희석하고 H₂O₂를 0.003%로 첨가한 용액과 상온에서 5분간 반응시켜 발색시켰다. 반응이 끝난 후 조직을 PBS로 10분씩 3회 세척하였다. 발색이 끝난 조직은 0.1% hematoxylin으로 주위조직에 대해 대조염색을 한 후 gelatin-coated slide에 얹어서 실내에서 건조시켰다. 발색이 끝난 후 xylene으로 투명화 시키고 polymount로 봉입하였다. 음성대조군은 각각 일차항체를 제외한 염색과정을 진행하였다.
   광학현미경으로 200배와 400배로 관찰하여 세포질이 갈색으로 염색된 부위를 양성 반응으로 간주하였다.

결     과

정량적 real time RT-PCR 결과
   TLR 2 mRNA의 농도는 진주종 조직에서 70.894±5.29 pg/ml로 정상외이도 피부조직에서 50.283±11.782 pg/ml보다 진주종 조직에서 유의하게 증가되어 발현되었다(p<0.05)(Fig. 1, Table 2).
   TLR 4 mRNA의 농도는 진주종 조직에서 2.799±0.151 pg/ml, 정상외이도 피부조직에서 1.891±0.352 pg/ml로 진주종 조직에서 유의하게 증가되어 발현되었다(p<0.05)(Fig. 2, Table 2).
   정상외이도 피부에서 TLR 2 mRNA의 농도는 50.283±11.782 pg/ml TLR 4 mRNA의 농도는 1.891±0.352 pg/ml로 TLR 2 mRNA가 TLR 4 mRNA에 비해 유의하게 증가되어 발현되었으며(p<0.05) 진주종 조직에서도 TLR 2 mRNA 70.894±5.29 pg/ml, TLR4 mRNA의 농도는 2.799±0.151 pg/ml로 TLR 2 mRNA가 TLR4 mRNA에 비해 유의하게 증가되어 발현되었다(p<0.05)(Figs. 1 and 2, Table 2).

면역조직화학염색 결과
   진주종 조직 17예와 정상외이도 피부조직 8예 모두에서 양성발현을 보였고 진주종 조직의 경우 TLR 2와 4 모두 상피층의 세포질과 상피층과 인접한 각질층에서 갈색으로 발현되었으며, 정상 외이도 피부조직에서는 상피층에서 TLR 2와 4가 양성으로 발현되었다(Figs. 3 and 4).

고     찰

   중이 진주종은 과증식하는 각질화세포와 동반되는 반복되는 감염에 의한 만성적인 염증을 특징으로 하고 반복되는 감염은 만성 이루 등의 임상증상 및 골파괴에 따른 다양한 합병증을 야기할 수 있어 진주종성 중이염에서의 감염과 염증에 대해 많은 연구가 있어왔다.¹⁾²⁾
   외부항체에 대한 인간의 면역체계는 선천면역과 적응면역으로 구성되며 선천면역계는 두 가지 경로를 통해 침입한 균을 병원균으로 인식한다. 하나는 미생물이 지닌 비자기성분(microbial nonself)의 인식과 또 다른 하나는 자기표식을 잃어버린 자기성분(missing self)을 인식한다. 전자는 미생물 대사 산물로 미생물들에서만 공통적으로 존재하는 병원성 연관 분자형태를 인식하는 것이다. 이러한 병원성 연관 분자형태를 인식하는 선천성 면역체계의 수용체를 형태인지수용체라 하며 이 수용체들이 침범병원체를 감지하고 병원성 연관 분자형태를 인식하면 염증유발 cytokine이나 chemokine 등의 발현을 유도하거나 반응성 질소, 활성화 산소, 항균펩타이드 등의 생성과 같은 생체방어기전을 활성화하도록 하는 신호가 만들어진다.⁵⁾ 또한 병원성 연관 분자형태를 인식하면 APC에 CD80과 CD86의 합성이 유도되며 이는 적응 면역체계가 선천 면역체계에서 유도됨을 의미한다.^5)10)12)
   TLR은 선천면역체계에서 병원성 연관 분자형태의 인지에 관여하는 형태인지수용체로 병원성 연관 분자형태를 인지하여 염증과 면역반응을 조절한다. 다른 형태인지수용체들처럼 TLRs은 다양한 PAMPs를 인식하는 데에 관여하고 있다. TLR은 지금까지 약 10종의 아형이 있는 것으로 알려져 있으며¹⁰⁾ TLR 2는 주로 그람양성균의 lipoproteins과 peptidoglycan에 반응하나 마이코박테리아의 세포벽, 효모의 세포벽 등과 그람음성균의 지다당류 등에도 반응하는 등 광범위한 반응범위를 갖고 있으며 최근 TLR 2는 고도로 정제한 지다당류에는 반응하지 않으며 Leptospira interrogans 등과 같은 특정균주의 지다당류에만 반응하는 것으로 알려졌다.¹²⁾ 하지만 TLR 4의 경우 TLR 4 유전자부위에 돌연변이가 있는 C3H/HeJ 마우스 등에서 지다당류에 반응이 감소됨이 알려져 TLR 4는 예민한 그람음성균의 지다당류를 인식하는 수용체로 밝혀졌다.¹²⁾ 그 외 TLR 5는 세균의 flagellin에 대한 반응을 조절하며 TLR 9는 세균의 DNA가 지닌 한 특징이라고 할 수 있는 unmethylated CpG DNA를 인식하는 데에 관여한다.¹³⁾ 나머지 다른 6개의 TLR들도 아직 분명히 밝혀지진 않았으나 여러 다른 PAMPs를 인식하는 데에 관여할 것으로 생각되고 있다. TLR은 모두 leucine이 풍부한 세포외 영역이 있고 바로 앞쪽에 Cys-rich 부위가 존재하는 것이 모든 TLR의 공통된 구조적 특징이다.⁶⁾ 세포질쪽 부위는 IL-1 수용체와 유사 세포질 영역을 가져 TIR 부위라고 불리우는데⁵⁾¹²⁾ TLR에 의한 신호전달에서 공통점은 TIR 도메인을 통한 NF-κB의 활성화이다. TLR이 리간드를 인지하면 같은 TIR 도메인을 가진 MyD88과 상호 작용하여 복합체를 형성한다.³⁾⁸⁾ MyD88의 C-말단의 TIR 도메인의 경우 TLR와의 복합체형성에 쓰여지고 N-말단의 death 도메인의 경우 Ser/ Thr kinase인 IRAK-1또는 IRAK-2와 복합체를 형성한다. IRAK-1은 다시 TRAF 6와 상호작용을 통해 NIK를 활성화시키게 된다. NIK의 활성화는 다시 IKK를 인산화 시키고 인산화 된 IKK는 다시 IκB를 인산화 시키고 결과적으로 NF-κB의 활성화를 야기한다. 활성화된 NF-κB는 핵으로 이동하여 전사인자로 작용하고³⁾⁸⁾ cytokine 또는 보조작용분자의 활성화를 유도하여 선천면역반응과 적응면역반응사이의 가교역할을 한다.^5)7)10) 또한 최근 선천성 면역체계에서 beta-defensin 2, 3 등의 항균단백질의 발현이 TLR 2와 4의 신호전달계에 의해 조절된다는 보고도 있다.^11)13)14) 따라서 많은 염증성 질환에서 TLR을 억제하여 질환의 악화를 방지하려는 시도가 있다.¹⁵⁾ 정상피부와 위장관 등의 표면 상피세포는 외부 병원균에 대한 첫 번째 방어선으로 중요한 역할을 하며 병원균과 상피세포의 상호 작용은 상피세포의 친염증성 cytokine, chemokine 등의 분비를 포함하는 다양한 반응을 유도한다.¹⁶⁾ 최근 위장관과 피부조직에서 병원균의 지다당류 등에 대한 TLR을 통한 특별한 세포내 신호 전달체계가 밝혀지고 있고 본 연구에서도 진주종의 상피세포에서 TLR 2와 TLR 4의 단백질이 발현되어 진주종조직의 상피세포층이 주위환경의 병원균에 대해 선천성 면역체계를 유도하는 주요한 부위일 것으로 생각된다. 본 연구에서 TLR 2와 TLR 4의 mRNA가 정상피부조직에 비해 진주종성중이염 조직에서 발현이 증가된 결과를 얻어 진주종의 감염 및 염증의 발현에 TLR 2와 TLR 4가 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 정상 피부 편평상피세포에서 TLR 2와 4 모두가 발현되며 TLR 2가 TLR 4보다 과발현된다는 보고가 있다.¹⁷⁾ 본 연구에서도 정상피부조직에서는 기존의 연구와 같은 결과를 얻었으며 진주종 조직에서는 정상피부조직에서보다 통계적으로 유의하게 TLR 4의 발현이 증가된 결과를 보였다.
   TLR 4는 TLR 2의 지속적인 자극을 통해 발현된다는 보고¹⁷⁾와 본 연구의 결과를 참고하였을 때 정상외이도는 진주종과 달리 상존하는 그람 음성균에 대한 염증 반응의 저하 또는 내성의 생성으로 그람 음성균을 병원균으로 인식하지 않으며, 감염시에도 병원균에 대한 반응의 저하로 염증이 발생하지 않을 가능성을 생각해 볼 수 있다. 정상 외이도피부조직과 진주종 조직 모두에서 TLR 2가 TLR 4보다 과발현되었다. 이는 그람 음성균에 감염된 위장관에서도 같은 결과를 보고한 연구를 통해 고찰해 보았을 때 기본적인 TLR 2와 TLR 4의 존재량의 차이일 수 있고, 그람 음성균의 지다당류 및 소량의 오염물질에도 반응하는 TLR 2의 광범위 반응의 결과일 수도 있다.⁸⁾¹⁴⁾
   진주종 조직과 정상 피부조직을 비교할 때 진주종내에서 TLR 4가 정상 피부조직보다 통계적으로 유의하게 과발현 되는 결과를 보인 것에 대해서는 본 연구의 결과만으로 해석하기에는 부족하다고 생각된다. 인체의 편평상피세포에서 다양한 TLR이 발현되고 지다당류 자극시에 TLR 4의 발현이 증가된다는 연구 결과가 있다.¹¹⁾ 따라서 진주종의 편평상피세포가 감염이 되어 있기 때문에 지다당류의 자극을 많이 받아 정상피부조직에 비해 TLR 4가 과발현되었다고 유추할 수 있다.
   위장관도 지속적인 세균의 자극이 있지만 정상대장에서는 TLR 4의 발현이 미약하고 염증성 대장질환에서 과발현 되어있고, 이 차이로 인하여 상재 세균이 병원균으로 작용한다는 결과가 있다.¹⁸⁾ 정상적인 피부조직도 주변환경에서 지속적인 세균의 자극이 있다. 이 상황에서 TLR 4의 발현 차이로 인한 세균을 병원균으로 인식하는 감수성의 차이가 발생할 수 있다. 그러므로 진주종 조직에서 정상 외이도피부조직에 비해 TLR 4의 과발현은 단순한 감염으로 인한 지다당류의 지속적 자극 외 다양한 원인이 있을 것으로 생각되며 이에 대한 지속적인 연구가 필요하겠다.
   최근에는 TLR 2와 4의 mRNA의 양과 HaCaT의 각질세포의 분화정도와 유의한 상관관계가 있으며 각질세포의 증식을 조절한다는 연구가 있어 진주종 조직에서의 TLR 2와 TLR 4의 발현이 정상외이도 피부에 비해 증가되어 발현된 것이 진주종조직의 각질세포의 증식에 대한 병인을 이해하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
   본 연구에서 진주종 조직에서 TLR 2와 4가 존재함을 확인하여 진주종의 선천면역체계에서 TLR 2와 4가 관여함을 알 수 있었고 정상피부조직에 비해 과발현됨을 확인하여 TLR 2와 4가 진주종의 반복적인 감염과 만성적인 염증에 의한 질환의 악화에 관여할 것으로 생각되었다. 아울러 진주종성 중이염의 합병증을 막고 만성적인 이루 등의 증상을 방지하기 위한 치료로 TLR을 억제하는 방법이 고안될 수 있음을 시사하였다.

결     론

   중이 진주종조직과 외이도 피부조직에서 면역조직화학염색결과 중이 진주종의 상피세포층에서 TLR 2와 TLR 4가 양성으로 발현되고 실시간 역전사 중합효소연쇄반응을 통해 TLR 2와 4의 mRNA 농도가 모두 진주종 조직에서 정상외이도 피부조직보다 통계적으로 유의하게 발현이 증가한 결과를 얻었다. 본 연구 결과로 진주종의 감염에 따른 선천 면역체계에 TLR 2와 4의 존재를 확인하였고 진주종의 감염에 따른 염증반응을 유도하는 과정에서 진주종조직의 상피세포층이 중요한 역할을 하며 정상외이도 피부조직에 비해 중이 진주종에서 TLR 2와 TLR 4의 발현이 증가되어 중이 진주종의 감염에 의한 염증반응 기전에 TLR 2와 4가 관여함을 알 수 있어 진주종의 감염 및 염증에 의한 병리 기전을 이해하는 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 생각된다.

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