교신저자：송시연, 705-717 대구광역시 남구 대명동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   암의 발생은 복잡하고 다양한 유전자의 변이로 인한 세포주기 조절능력의 상실에 의해 기인한다고 보고되고 있다. 최근 들어 변이가 일어날 경우 암의 발생을 증가시키는 많은 유전자 및 단백들이 보고되고 있으며 이들 중에는 세포주기를 순차적으로 진행되도록 조절하며 세포주기가 가속화될 때 DNA 복구를 담당하는 세포조절인자들이 포함되어 있음이 밝혀졌다.¹⁾²⁾
   이들 중 cyclin 단백은 cyclin-dependent kinase(CDKs)와 복합체를 형성하여 유핵세포의 세포주기 조절에 있어 가장 중요한 역할을 담당한다. 이런 cyclin 단백의 종류로는 A, B, C, D, E형 등 15가지 종류가 알려져 있으며 각각 다른 종류의 cyclin 단백이 각각의 세포주기에 작용한다.³⁾ 이 중 Cyclin D1 유전자는 세포주기 중 G1기의 진행에 작용하여 세포주기 조절과 성장인자에 대한 세포반응에 관여하는 신호변환 경로의 가교 역할을 한다. 즉 cyclin D1 단백은 세포주기 중 G1기에서 S기로의 전환을 촉진하도록 유도하는데 이는 정상세포에서는 물론 암세포에서도 필수적이다.⁴⁾⁵⁾ 그러므로 cyclin D1 단백의 과발현이 종양 억제 유전자와 종양 유전자에 영향을 주어 세포형질 변환이 일어난다고 알려져 있고 최근 들어 유방암, 식도암, 폐암 및 두경부 편평세포암에서 Cyclin D1 유전자 증폭 및 단백의 과발현이 보고되어 있다.⁵⁾⁶⁾
   이러한 cyclin D1 단백의 과발현이 두경부 종양 분야에서 종양 발생에 많은 영향을 미치는 것으로 보고되고 있으나 지금까지 명확하게 규명되어 있지 않으며 특히 후두의 양성 점막질환과 편평상피 형성이상 및 편평세포암종에 대한 연구는 아직 미미한 상태이다.
   이에 본 연구에서는 후두 양성 점막질환과 편평상피 형성이상 및 편평세포암종에서 cyclin D1 단백의 과발현을 면역조직화학적 염색을 통하여 관찰함으로써 cyclin D1 단백의 과발현이 후두 편평세포암종의 초기 발암기전 단계부터의 관련여부 및 조직병리학적 분화도, 원발부위 및 병기에 따른 상호관련성을 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

   1994년 3월부터 1996년 12월까지 본원에서 수술 중 획득한 조직 중 병리학적 결과가 후두의 양성 점막질환, 형성이상 및 편평세포암종으로 보고된 62명의 환자의 파라핀 블록 78예를 대상으로 하였고 편평세포암종의 병기는 2002년 미국 암 연합위원회(The American Joint Committee on Cancer, AJCC)의 병기 분류법에 의거하였다.
   면역염색을 위해 먼저 파라핀 블록을 4 μm 두께의 절편으로 만들어 슬라이드 글래스에 부착시킨 후 xylene으로 파라핀을 제거하였다. 100%, 90% 및 75%의 알코올로 재수화한 후 3% H₂O₂에 15분간 작용시킨 다음 Tris 완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하였다. 시료를 부착한 슬라이드 글래스를 0.21% citric acid 용액에 넣고 5분간 4회 극초단파로 처치한 후 실온에서 protein blocker(Zymed, USA)를 10분간 도포한 후 건조시켰다. 일차항체인 cyclin D1 R-124(Santa Cruz, Germany)를 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. 이차항체인 link antibody(LSAB kit, DAKO, USA)를 15분간 도포한 후 Tris 완충액으로 3회 세척하였다. Streptavidin-HRP(Zymed, USA)을 15분간 도포한 후 Tris 완충액으로 3회 세척한 다음 3-amino-9-ethyl carbazole(AEC)를 10분간 도포하여 발색하고 10% Mayer's hematoxylin으로 대조염색하였다. 매 염색시마다 양성 및 음성 대조군을 사용하였는데 양성 대조로는 이미 cyclin D1 양성으로 판명된 유방암 조직을 이용하였고 음성 대조로는 일차항체를 도포하지 않은 채로 염색을 진행한 슬라이드를 이용하였다.
   판정은 1인의 병리학자가 시행하였는데 병변부위에서 핵이 진한 적갈색으로 염색된 경우 양성 세포로 판정하였으며 이러한 양성 세포의 수가 전체의 5% 미만인 경우 1점, 5~50% 미만인 경우 2점, 50% 이상인 경우 3점으로 판정하였다. 또한 염색 강도에 따라 약염색시 1점, 강염색시 2점으로 판정하여 두 점수의 합이 4점 이상인 경우 cyclin D1 양성으로 판정하였다.
   대상군의 임상정보는 병록지 고찰을 통하여 획득하였으며, 통계학적인 분석은 관련성은 Fisher's Exact test(SPSS program, version 10.0)를 이용하였으며 유의수준은 0.05 이하로 하였다.

결     과

   환자의 성별 및 연령 분포를 살펴보면 총 62명 중 남자는 58예(93.5%), 여자는 4예(6.5%)이었고 환자의 연령은 35세에서 77세 사이였고 평균 연령은 59.8세이며 60대가 62예 중 25예(40.3%)로 가장 많았다.
   조직병리학적 분류로는 파라핀 블록 78예 중 후두 각화증 및 만성 후두염은 11예(14%), 후두 편평상피 형성이상 및 편평상피내암종은 23예(29.5%)였으며, 후두 침윤성 편평세포암종이 44예(56.4%)로 가장 많았다(Table 1).
   Cyclin D1 단백의 양성 발현은 후두 각화증 및 만성 후두염 11예 중 6예(54.5%), 경도 및 중등도 후두 편평상피 형성이상 5예 중 3예(60.0%), 고도 후두 편평상피 형성이상 및 편평상피내암종 18예 중 12예(66.7 %)에서 양성이었고 후두 침윤성 편평세포암종 44예 중 36예(81.8%)에서 양성으로 주로 병변부위 세포의 핵에 진한 적갈색으로 염색되었다(Fig. 1). 후두 침윤성 편평세포암종에서 cyclin D1 단백의 양성 발현(81.8%)이 통계학적으로 유의성 있게 후두 양성 질환, 형성이상 및 편평상피내암종보다 높았다(Table 1, p<0.05).
   후두 침윤성 편평세포암종 44예에서 조직병리학적 분화도에 따른 cyclin D1 단백의 발현은 조직의 분화도가 좋은 13예 중 10예(76.9%)에서 양성, 중등도 분화도인 24예 중 19예(79.2%)에서 양성, 분화도가 나쁜 7예(100.0%) 모두 양성이었다(Table 2). 원발부위에 따른 cyclin D1 단백의 발현은 성문상부인 경우 23예 중 21예(91.3%)에서 양성, 성문부인 경우 14예 중 10예(71.4%)에서 양성이었고 범성문부인 경우 7예 중 5예(71.4%)에서 양성이었다(Table 3). 원발병소 병기에 따른 cyclin D1 단백의 발현은 제 1 기인 경우 15예 중 11예(73.3%)에서 양성, 제 2 기인 경우 11예 중 8예(72.7%)에서 양성, 제 3 기인 경우 16예 중 15예(93.8%)에서 양성, 제 4 기인 경우 2예(100.0%) 모두 양성이었다(Table 4). 또한 림프절 병기에 따른 cyclin D1 단백의 발현은 림프절 전이가 없는 경우 27예 중 20예(74.1%)에서 양성, 제 1 기인 경우 5예(100.0%) 전부에서 양성, 제2기인 경우 12예 중 11예(91.7%)에서 양성이었다(Table 5). 그러나 후두 침윤성 편평세포암종에서 조직병리학적 분화도, 원발부위, 운발병소 병기 및 림프절 병기에 따른 cyclin D1 단백 양성 발현과는 통계학적 유의성이 없었다(p>0.05).

고     찰

   Cyclin 단백은 CDKs와 복합체를 형성하여 유핵세포의 세포주기를 조절하는 가장 중요한 단백으로 정상세포에서 cyclin 단백의 과발현이 Rb 단백의 세포주기 조절 억제 능력의 소실 및 다른 종양 유전자의 활성화를 초래함으로서 세포형질 변환이 일어난다고 보고되고 있다.³⁾⁷⁾
   Cyclin 단백은 처음 쥐의 난세포의 수정 후에 고농도로 축적되었다가 세포가 분열되면 즉시 파괴되는 단백으로 발견되었으며 종류로는 A, B, C, D, E형 등 15가지 종류가 알려져 있고 각각 다른 종류의 cyclin이 각각의 세포주기에 작용한다.³⁾⁸⁾ 이 중 cyclin C의 작용은 잘 알려져 있지 않지만 cyclin D, E는 세포주기의 G1에서 S기로의 전환에, cyclin A, B는 G2에서 M기로의 전환에 작용한다.³⁾⁹⁾
   지금까지 알려진 Cyclin D 유전자에는 Cyclin D1, D2, D3가 있다. 이 중 Cyclin D1 유전자는 정상적으로 염색체 11q13에 위치하여 세포주기 중 G1기의 진행에 작용하여 세포주기 조절과 성장인자에 대한 세포반응에 관여한다.¹⁾¹⁰⁾ 즉 cyclin D1은 세포주기 G1기에 발현되어 동반 물질인 CDK4, 6와 복합체를 형성하여 serine이나 threonine의 전이효소 역할을 하게 된다.⁷⁾ 그러므로 이 복합체는 종양 억제 유전자인 retinoblastoma gene(Rb)의 산물인 Rb 단백의 과인산화를 유도하여 Rb 단백의 세포주기 조절 억제 능력의 소실을 초래하고 이로 인하여 Rb 단백에 의하여 조절되던 E2F라는 전사인자가 활성화됨으로서 세포주기 S기에 필요한 촉매가 합성됨으로써 세포의 분화가 촉진된다.⁵⁾⁹⁾ 즉 cyclin D1 단백의 과발현은 세포가 G1기에서 머무르는 시간을 짧게 하여 G1기에서 S기로의 이행을 촉진시키는 역할을 하며 Jiang 등¹¹⁾은 배양된 세포에서 cyclin D1 단백의 과발현은 G1기를 짧게 하고 외부 성장인자에 대한 세포의 의존도를 줄여주며, Bodrug 등¹²⁾ 및 Lovec 등¹³⁾은 Cyclin D1의 과발현이 ras나 myc 유전자를 활성화하여 정상 세포를 변형시키는 것으로 보고하고 있다.
   Cyclin D1 단백 과발현의 두경부 편평세포암에서의 임상적 의미는 아직 명확하게 규명되어 있지 않다. 그러나 후두 편평세포암을 대상으로 한 연구에서 Cyclin D1 유전자의 증폭과 단백의 과발현이 임상경과와 연관성이 있다는 보고가 있다.⁷⁾¹⁴⁾ 진행된 유방암이나 식도암에서 원발부위의 염색체 11q13 부위가 증폭된 경우 생존율이 낮다는 보고가 있으며, 진행된 두경부 암에서도 원발부위의 미분화 암세포에서 염색체 11q13 부위의 증폭을 보고하고 있다.⁵⁾¹⁵⁾ 본 연구에서도 cyclin D1 단백의 발현은 후두 각화증 및 만성 후두염에서 후두 편평상피 형성이상, 편평상피내암종, 침윤성 편평세포암종으로 갈수록 양성 발현율이 통계학적으로 유의있게 증가하였고(p<0.05), 후두 침윤성 편평세포암종에서는 81.8%의 가장 높은 양성 발현율을 나타내어 다른 보고자들의 결과와 일치하였다.⁷⁾¹⁴⁾ 이러한 결과는 Cylcin D1이 후두 편평상피내암종의 초기 발암기전 및 침윤성 편평세포암종으로의 진행에 중요한 역할을 담당함을 시사하는 소견으로 볼 수 있다.
   또한 후두 침윤성 편평세포암종에서의 Cylcin D1의 양성 발현율은 조직병리학적 분화도가 나쁠수록 증가하였고 원발병소 병기에서는 초기 병변보다 진행성 병변으로 갈수록 증가하였으며 림프절 병기에서는 림프절 전이가 없는 경우보다 있는 경우에 높게 나타났으나 통계학적 유의성을 찾을 수는 없었다. 이러한 결과들은 국내에서 보고된 Tae 등,¹⁶⁾ Kim 등,¹⁷⁾ Kim 등,¹⁸⁾ So 등,¹⁹⁾ Do 등²⁰⁾의 결과와는 일치하지는 않지만 이는 연구 대상군의 수가 적어 다른 보고자들의 결과와 다르게 나타날 수 있어 보다 더 많은 대상군을 이용한 연구와 함께 세포주기에 관련되는 다른 유전자 및 단백질이 cyclin D1 단백의 발현에 영향을 미치는지에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.⁷⁾¹⁴⁾

결     론

   후두 침윤성 편평세포암종에서 분화도가 나쁠수록, 원발부위의 병기가 높을수록, 그리고 림프절 전이가 있는 경우 cyclin D1의 양성 발현율이 높게 나타났으나 이에 따른 통계학적 유의성을 찾을 수는 없었다.
   그러나 cyclin D1 단백의 양성 발현율은 후두의 각화증, 만성 염증, 편평상피 형성이상, 편평상피내암종 및 침윤성 편평세포암종으로 진행할수록 의미 있게 높아지므로 cyclin D1이 전암성 병변에서 후두 편평세포암종으로 진행하는 발암기전 및 진행에 중요한 역할을 담당할 것으로 생각되며 이에 대한 더 많은 연구가 필요하다.

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